泛素介导的MTDH蛋白降解机制及调控研究

发布时间：2018-11-24 13:35

【摘要】：乳腺癌是女性多发恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康,其发病率逐年递增,目前已跃居女性恶性肿瘤首位,成为女性肿瘤致死第二大原因。虽然近年来在乳腺癌的早期发现、早期诊断及综合治疗等方面都获得了很大的进步,但是,乳腺癌伴转移患者的5年生存率仍增幅缓慢,目前针对乳腺癌患者的临床治疗方式还无法从根本上解决肿瘤的复发与转移问题。乳腺癌的发生发展与转移是一个多因素、多环节、多阶段的复杂演变过程,然而截至目前乳腺癌的发生发展和转移机理仍未阐明,因此,改善乳腺癌患者的预后和生活质量很大程度上依赖于对其发生发展和转移机理全面而深入的研究。MTDH蛋白在多种恶性肿瘤中呈高表达状态,尤其在乳腺癌细胞中MTDH异常积聚。MTDH蛋白与乳腺癌的发生发展和转移密切相关,然而直至目前,其在肿瘤细胞中异常积聚的机理仍未阐明。我们前期实验发现MTDH蛋白在乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞中的多聚泛素化水平明显低于正常人胚肾HEK293细胞,提示MTDH蛋白在乳腺癌细胞中的过表达是转录和降解两方面失衡的结果,MTDH蛋白降解异常可能是其在乳腺癌细胞中高表达及易转移的主要原因之一。通过免疫共沉淀串联质谱分析筛选得到泛素连接酶FBXW7与MTDH蛋白之间存在相互作用,提示FBXW7可能是MTDH蛋白的特异性泛素连接酶。目的:为了探讨泛素连接酶FBXW7与MTDH蛋白之间相互作用机制,(1)应用免疫共沉淀及GST-Pulldown技术体内外鉴定FBXW7与MTDH蛋白之间的相互作用关系;(2)探讨不同亚型FBXW7对MTDH蛋白稳定性影响;(3)探讨FBXW7对MTDH蛋白泛素化水平的调控作用;(4)检测FBXW7对MTDH蛋白半衰期的调控作用,希望阐明MTDH蛋白在乳腺癌细胞异常积聚的机理;(5)在乳腺癌细胞中探讨FBXW7通过泛素蛋白酶体途径调控MTDH蛋白降解,进而对乳腺癌细胞增殖、移行、侵袭和凋亡等生物学行为的影响。本课题有望最终阐明泛素连接酶FBXW7通过介导MTDH蛋白降解在乳腺癌细胞发生发展和转移中的作用,为发掘乳腺癌治疗新靶点奠定理论基础。方法:(1)首先构建MTDH真核表达载体pcDNA-3.1-MTDH,转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,利用免疫共沉淀及液相串联质谱分析筛选乳腺癌细胞中MTDH蛋白相互作用蛋白;其次,分别以MTDH蛋白和FBXW7蛋白为诱饵蛋白进行免疫共沉淀,从正反两方面验证MTDH蛋白与泛素连接酶FBXW7之间的相互作用关系;最后利用原核表达系统表达并纯化GST-FBXW7α蛋白,利用GST-Pulldown技术体外鉴定MTDH蛋白与泛素连接酶FBXW7之间相互作用关系。(2)首先,构建FBXW7不同亚型真核表达载体p Flag-CMV-FBXW7α、pFlag-CMV-FBXW7β、pFlag-CMV-FBXW7γ和FBXW7干涉载体p Slilencer4.1-shFBXW7,上述载体分别转染乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常人胚肾HEK293细胞,检测FBXW7对MTDH蛋白稳定性影响;其次,以MTDH蛋白为诱饵蛋白进行免疫共沉淀实验,检测在FBXW7过表达及干涉表达条件下MTDH蛋白泛素化水平变化情况;最后,用蛋白合成抑制剂放线菌酮分别处理FBXW7过表达和干涉表达细胞,检测MTDH半衰期,最终阐明FBXW7作为MTDH蛋白泛素连接酶调控MTDH蛋白降解机制。(3)FBXW7真核表达载体pcDNA-3.1-FBXW7α转染乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBR3,通过MTT细胞增殖、细胞划痕、Transwell、细胞凋亡检测等实验阐明FBXW7通过介导MTDH蛋白泛素化降解途径对乳腺癌细胞生物学行为的影响。结果:(1)首先,通过免疫共沉淀及液相串联质谱检测分析,筛选出乳腺癌MDA-MB-231细胞中MTDH相互作用蛋白11个,其中含有一个泛素连接酶FBXW7;其次,在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别以MTDH和FBXW7为诱饵蛋白进行免疫共沉淀,从正反两个方面证实了MTDH蛋白和FBXW7蛋白之间存在相互作用;最后利用原核表达系统成功表达出GST-FBXW7融合蛋白,并利用GST-Pulldown实验在体外进一步证实了MTDH蛋白和FBXW7蛋白之间存在相互作用关系。(2)首先,成功构建了FBXW7不同亚型真核表达载体pFlag-CMV-FBXW7α、pFlag-CMV-FBXW7β和pFlag-CMV-FBXW7γ,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,发现FBXW7α、FBXW7β和FBXW7γ均能下调MTDH蛋白水平,其中以FBXW7α作用最明显;成功构建FBXW7干涉载体pSlilencer4.1-shFBXW7,转染人胚肾HEK293细胞,发现干涉细胞内源性FBXW7表达后,MTDH蛋白水平明显上调;其次,以MTDH为诱饵蛋白进行免疫共沉淀实验,发现FBXW7过表达组,MTDH蛋白泛素化水平显著上调,然而FBXW7干涉组,MTDH蛋白泛素化水平明显下调;最后,检测FBXW7对MTDH蛋白半衰期影响,与阴性对照组相比,FBXW7过表达组细胞MTDH蛋白半衰期明显缩短,从12小时缩短至6小时,然而FBXW7干涉组,MTDH基本不降解。(3)乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞,MTDH蛋白呈高表达,FBXW7与MTDH蛋白表达呈负相关,提示FBXW7介导的MTDH蛋白泛素化降解异常可能是MTDH蛋白在乳腺癌细胞异常聚积的主要原因之一。乳腺癌细胞过表达FBXW7均能抑制细胞增殖、移行和侵袭能力,并诱导乳腺癌细胞凋亡,然而MTDH蛋白可以在一定程度逆转过表达的FBXW7对细胞生物学行为的影响,因此推断FBXW7通过介导MTDH蛋白的泛素化降解而抑制乳腺癌细胞的恶性表型。结论:(1)体内外实验均发现FBXW7与MTDH蛋白存在相互作用关系。(2)泛素连接酶FBXW7对MTDH蛋白丰度起到负调控作用,其中以FBXW7α作用最明显。(3)FBXW7在细胞内作为MTDH蛋白的泛素连接酶介导其泛素化;(4)蛋白半衰期检测实验发现,FBXW7通过泛素蛋白酶体途径调控MTDH蛋白降解,从而负向调控MTDH蛋白半衰期。(5)乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞中,FBXW7与MTDH蛋白表达呈负相关,提示FBXW7介导的MTDH蛋白泛素化降解异常可能是MTDH蛋白在乳腺癌细胞异常聚积的主要原因之一。(6)乳腺癌MDA-MB-231和SKBR3细胞中,FBXW7通过泛素蛋白酶体途径调控MTDH蛋白降解,从而抑制乳腺癌细胞增殖、移行和侵袭能力,促进乳腺癌细胞凋亡。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9
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本文编号：2353922