miR-200s调控CAFs细胞活化及活性维持并促进细胞外基质重塑介导的乳腺癌细胞侵袭转移的机制研究

发布时间：2018-11-27 15:26

【摘要】：第一章miR-200及其靶基因TCF12和Fli-1通过调节乳腺癌CAFs细胞的活化和细胞外基质重塑促进乳腺癌细胞的侵袭转移目的:探索miR-200s使CAF活化,调控ECM蛋白的异常沉积,并促进乳腺癌细胞的侵袭转移。方法:(1)原代分离获得乳腺癌病人来源的正常成纤维细胞(NF:Normal fibroblast)和肿瘤相关成纤维细胞(CAF:Cancer-associated fibroblast)。(2)qRT-PCR检测这20对NF和CAF细胞中miR-200s的表达。(3)利用Transwell共培养系统,将乳腺癌细胞与NF细胞共培养,qRT-PCR检测miR-200s的表达。(4)qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶实验确定miR-200s的靶基因。(5)利用sh RNA和基因过表达技术,验证miR-200s及其靶基因促进CAF的活化。(6)利用胶收缩、qRT-PCR和Western Blot实验验证miR-200s及其靶基因对ECM重塑的影响(7)癌细胞侵袭实验和裸鼠成瘤模型验证miR-200s及其靶基因促对乳癌转移的影响。结果:(1)原代培养获得20对成对的乳腺癌病人来源的NF和CAF细胞。(2)qRT-PCR结果显示miR-200s在CAF中下调的真实性和普遍性。(3)qRT-PCR检测发现经癌细胞共培养激活的NF细胞中miR-200s表达下调。(4)qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶实验表明TCF12和Fli-1分别是miR-141和miR-200b的靶基因。(5)利用sh RNA和基因过表达技术,发现低表达miR-200s的NFs具有活化的CAFs的特征,CAF活化标志物a-SMA、FAP表达增加,其迁移侵袭能力增强;CAFs中恢复miR-200s的表达,部分抑制CAF功能并出现NF表型特征。(6)利用胶收缩、qRT-PCR和Western Blot实验验证miR-200s及其靶基因通过调控下游一系列ECM成分相关基因,尤其是FN和LOX的表达,促进ECM重塑。(7)体内裸鼠实验和临床病例研究更进一步证实miR-200s及其靶基因对CAF活化、ECM重塑、乳癌转移的影响。结论:(1)下调的miR-200s导致细胞分化相关的靶转录因子Fli-1和TCF12异常表达,促进乳腺癌CAFs活化。(2)miR-200s及其靶基因Fli-1和TCF12介导了乳癌微环境ECM重塑,促进肿瘤细胞的侵袭与转移。揭示CAFs促进乳腺肿瘤转移的新的分子机制,为靶向肿瘤微环境的治疗提供新靶点。第二章离体CAFs活化的自我维持目的:探索miR-200s维持CAF的活化状态及机制。方法:(1)5’-aza处理CAF细胞,qRT-PCR检测miR-200s的表达。(2)Western Blot检测成对NF和CAF细胞中甲基化转移酶的表达差异。(3)利用基因干扰技术,沉默CAF细胞中Dnmt3b的表达,qRT-PCR检测miR-200s的表达。(4)qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶验证miR-200b/200c的靶基因Dnmt3b。(5)TGF-b1处理CAF后,qRT-PCR检测miR-200s的表达,Western Blot检测Dnmt3b及miR-200s的靶基因TCF12和Fli-1的表达。结果:(1)5’-aza处理CAF细胞,qRT-PCR发现miR-200s表达增加。(2)Western Blot结果显示CAF细胞中Dnmt3b表达明显高于NFs。(3)qRT-PCR结果显示沉默CAF细胞中Dnmt3b的表达,miR-200s表达增加。(4)qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶结果显示Dnmt3b是miR-200b/200c的靶基因。(5)qRT-PCR发现TGF-b1处理CAF细胞,qRT-PCR结果显示miR-200s下调,撤离外源性TGF-b1并正常培养CAF细胞,miR-200s持续低表达;而Western Blot结果显示Dnmt3b表达增加,同时靶基因TCF12和Fli-1的表达也增加。结论:(1)CAF细胞中,Dnmt3b高表达,并可能通过基因甲基化使miR-200s表达下调。(2)CAF细胞中,Dnmt3b与miR-200s形成反馈调控环,维持CAF活化。(3)TGF-b1参与调节Dnmt3b-miR-200s环路,促进并维持CAF活化。(4)Dnmt3b与TGF-b1形成正反馈调节环,维持CAF的活化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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本文编号：2361289