靶向抑制EGFR信号通路治疗骨巨细胞瘤的机制研究

发布时间：2018-12-05 20:41

【摘要】：背景:骨巨细胞瘤(Giant cell tumor of bone,简称GCTB)是一种具有侵袭性呈膨胀性生长,并且以溶骨性破坏为主要特点的良性骨肿瘤,大约占所有原发骨肿瘤的5%左右。骨巨细胞瘤主要有三种细胞成分构成:破骨细胞样多核巨细胞,单核梭状基质细胞和圆形的单核细胞或巨噬细胞来源的单核细胞。骨巨细胞瘤的发病和复发机制至今仍不清楚,由于少部分骨巨细胞瘤有恶变或转移的潜能,其生物学行为及预后目前难以预测。研究表明基质细胞能吸引和促进单核-巨噬细胞分化形成多核巨细胞,因此目前多认为基质细胞是致瘤的重要因素。骨巨细胞瘤的治疗当前仍以手术治疗为主,手术切除的方式主要包括:瘤内刮除术、外科边缘病灶切除术以及En-bloc整块切除术。尽管完整的手术切除肿瘤联合双膦酸盐的辅助治疗能明显降低骨巨细胞瘤的局部复发率,但目前报道的27%-65%的局部复发率仍不容乐观。除去手术治疗,骨巨细胞瘤对化疗放疗均不敏感,这使得当肿瘤因为解剖位置、远处转移、累及多个节段以及功能要求,难以获得满意的切除时,缺乏行之有效的辅助治疗手段。目前主要的药物治疗有双膦酸盐和狄诺塞麦,两者均以抑制破骨细胞样多核巨细胞引起的的骨吸收来发挥治疗作用。对于致瘤的基质细胞,两者均无直接或间接的作用,因而这些治疗很难避免肿瘤局部的再次复发。此外,骨巨细胞瘤多伴有丰富的血供和大量的血管新生,临床上约有10-14%的骨巨细胞瘤伴有动脉瘤样骨囊肿的形成。因此若能找到同时抑制多核巨细胞的分化形成和基质细胞瘤的增殖,并能抑制血管新生的全新治疗方法,将能更加有效地控制肿瘤的发生、发展、复发和转移。EGFR是一个170k Da的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,为erb B(HER)家族成员,又称为erb Bl/HERl,主要由胞外配体结合结构域(ECD,621个氨基酸)、跨膜亲脂结构域(TM,23个氨基酸)、胞内激酶结构域(542个氨基酸)构成。受体EGFR识别并结合胞外配体后,发生二聚化和磷酸化,并激活下游的Ras-MAPK信号通路、PI3K-AKT-m TOR信号通路、Src-JAK-STATs信号通路和PLCγ-PKC信号通路,调节细胞的周期进程、增殖、凋亡、迁移等活动。EGFR过表达、突变或过度激活将持续激活下游信号通路,引起细胞异常增殖,血管新生和发生转移,导致肿瘤的发生发展。已有相关文献研究表明EGFR信号通路在GCTB疾病的发生发展中起着举足轻重的作用,其在基质细胞的增殖,破骨细胞的形成上可能起着重要的调控作用。这提示着EGFR信号通路是一个潜在的极具价值的骨巨细胞瘤治疗靶点。研究目的:(一)对比GCTB肿瘤细胞与正常人间充质干细胞以及GCTB肿瘤标本与正常人松质骨中EGFR信号通路中重要的磷酸化蛋白表达差异。(二)观察特异性阻断EGFR信号通路对于GCTB多核巨细胞的形成、分化的影响。(三)观察特异性阻断EGFR信号通路对于GCTB基质细胞增殖或凋亡的影响。(四)观察特异性阻断EGFR信号通路对GCTB条件培养基诱导的破骨细胞的形成的影响;探索GCTB基质细胞调控破骨细胞成熟的机制和EGFR信号通路调控破骨细胞分化形成的时间窗。(五)观察特异性阻断EGFR信号通路对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移以及对GCTB基质细胞条件培养基诱导的血管新生的影响。(六)利用动物模型观察特异性阻断EGFR信号通路在体内对GCTB治疗的效果。研究方法:(一)应用蛋白质免疫印迹实验和免疫组织化学实验对比GCTB肿瘤细胞与正常人间充质干细胞以及GCTB肿瘤标本与正常人松质骨中EGFR信号通路中重要的磷酸化蛋白表达差异。(二)应用TRAP染色实验、PCR实验以及骨片实验观察使用酪氨酸激酶抑制剂靶向阻断EGFR信号通路后对GCTB多核巨细胞的形成及分化的影响。(三)应用荧光染色实验观察特异性阻断EGFR信号通路对GCTB基质细胞增殖的影响,流式细胞实验观察其对基质细胞凋亡的影响。(四)应用TRAP染色实验及PCR实验明确特异性阻断EGFR信号通路对GCTB条件培养基诱导的破骨细胞的形成、分化的影响及机制。(五)应用细胞增殖实验、蛋白质免疫印迹实验、Transwell实验、血管新生实验观察EGFR信号通路在HUVECs增殖、迁移以及对GCTB基质细胞条件培养基诱导的血管新生的影响作用。(六)通过胫骨原位注射荷瘤构建GCTB小鼠动物模型,给予酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib靶向抑制EGFR信号通路,观察其在体内对GCTB溶骨破坏的治疗效果;通过鸡胚绒毛尿囊膜荷瘤模型,观察不同浓度Gefitinib靶向抑制EGFR信号通路后成瘤的效果。结果:(一)GCTB肿瘤标本及原代细胞中EGFR信号通路异常激活。(二)我们利用酪氨酸激酶抑制剂靶向阻断EGFR信号通路后,GCTB多核巨细胞形成以及分化受到明显抑制,其导致的局部溶骨破坏也被有效抑制,并呈药物剂量依赖性;随着药物浓度上升RANKL的表达减弱,而OPG的表达增强。(三)特异性阻断EGFR信号通路能有效抑制GCTB基质细胞的增殖,但对基质细胞的凋亡无明显影响。(四)特异性阻断EGFR信号通路能有效抑制GCTB条件培养基诱导的破骨细胞的形成;EGFR信号通路主要在破骨细胞形成的早期阶段起调控作用;基质细胞的EGFR信号通路被阻断后,其分泌的细胞因子:NFATc1、TRAP、MMP9、M-CSF、MCP-1、SDF-1表达水平明显下降。(五)阻断EGFR信号通路能有效抑制HUVECs的增殖、迁移以及基质细胞条件培养基诱导的血管新生。(六)裸鼠体内实验结果显示:阻断EGFR信号通路能有效地抑制GCTB局部的溶骨破坏,Gefitinib在裸鼠体内无明显毒副作用;鸡胚绒毛尿膜囊荷瘤实验显示:当Gefitinib浓度达到10μM,鸡胚绒毛尿囊膜上无法成瘤。结论:本研究中我们通过蛋白质免疫印迹实验和免疫组化实验证实了EGFR信号通路在GCTB中呈异常高表达状态。通过应用EGFR小分子化合物抑制剂靶向阻断EGFR信号通路,观察到破骨细胞样多核巨细胞的形成以及基质细胞的增殖和对单核细胞的趋化募集作用受到明显抑制;由基质细胞诱导的人血管内皮细胞的迁移及血管新生也得到有效地控制;在小鼠动物模型体内实验中,抑制EGFR能有效阻止肿瘤对骨结构的溶骨破坏,且无明显毒副作用;鸡胚绒毛尿膜囊荷瘤实验显示,抑制EGFR信号通路能阻止GCTB的成瘤和血管新生。这一研究结果提示着EGFR信号通路在GCTB的发生发展中起到重要的调控作用。目前EGFR靶向抑制剂已在多种恶性肿瘤的临床治疗中得到应用,我们期待在不久的将来EGFR信号通路能成为GCTB临床治疗的全新靶点。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1

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