整合素ανβ6在IL-8介导的结肠癌迁移侵袭中的作用及分子机制研究

发布时间：2018-12-07 07:27

【摘要】：研究背景和意义结肠癌在全球男性和女性最常见的肿瘤类型中分别位列第二位和第三位,并且是一种呈现快速进展的肿瘤。由于结肠癌的高侵袭性,20%-50%的结肠癌患者会在确诊5年内因广泛的肿瘤扩散转移而死亡。复发和转移是结肠癌致死的主要因素,以至于50%以上的患者发展到肿瘤无法根治性切除的程度。虽然在结肠癌的早期快速诊断和治疗方面已经取得一定的进展,但是其5年生存率仍然很低,尤其是已有远处转移的患者。结肠癌的分子发病机制在很大程度上仍然不清楚,因此,进一步地了解结肠癌发生发展的分子机制,对改善其治疗方案及预后情况都将有很大的帮助。肿瘤和基质之间的相互作用,可以促进肿瘤的进展,这可以通过多种因素介导,其中就包括趋化因子。趋化因子是一类由细胞分泌至胞外的、低分子量的趋化蛋白的总称,最初因可以吸引白细胞趋集到炎症部位而得名,并在炎症反应、淋巴归巢以及组织发育等生理病理过程中发挥重要作用。Interleukin-8 (IL-8),又称CXCL8,是人类CXC趋化因子中最具特征和效力的细胞因子,其在炎症、感染和其它疾病状态中的作用已得到深入研究。IL-8有两种受体,CXCR1(IL-8RA)和CXCR2 (IL-8RB),广泛分布于各种正常及异常细胞膜上。IL-8以高亲和度与CXCR1和CXCR2结合,进一步激活下游细胞通路介导生物学作用。在肿瘤方面,IL-8可以通过刺激血管内皮细胞从而促进血管生成、趋化中性粒细胞至肿瘤部位、促进肿瘤细胞的增殖迁移侵袭、抑制肿瘤细胞的凋亡等参与肿瘤的发生发展。众多研究表明,IL-8在结肠癌、胃癌和胰腺癌等肿瘤的血管生成、生长和侵袭转移中起关键作用。此外,IL-8在多种恶性肿瘤种具有预后价值,包括肝癌、鼻咽癌、胃癌、肺癌和前列腺癌。侵袭和转移是肿瘤细胞的主要特质之一,这其中涉及多种细胞生物学活动,比如侵袭细胞与相邻细胞外基质的相互作用发生明显变化,而整合素就是一类介导肿瘤细胞与细胞外基质作用的一类膜蛋白。整合素是一类异源二聚体跨膜受体的大家族,由一个α亚基和一个β亚基构成,在肿瘤的迁移转移中发挥着关键作用,从而有助于肿瘤的侵袭进展。整合素αvβ6是β6亚基可以构成的唯一异二聚体,αvβ6一般只表达于上皮细胞。整合素αvβ6通常在正常组织中不表达或者低表达,但在胚胎组织形成、组织修复以及病理状态尤其是肿瘤的发生发展过程中高表达。我们的前期研究已经证实,整合素αvβ6可以促进肿瘤细胞的增殖,抑制肿瘤的凋亡,促进肿瘤的定向迁移和侵袭转移,诱导基质金属蛋白酶的分泌并且在肿瘤化学耐药的过程中发挥着重要作用。已有研究表明,IL-8与结肠癌细胞的侵袭转移密切相关。IL-8在正常健康组织中几乎检测不到,但在病理状态下可被促炎性细胞因子如TNF-α或者IL-1β迅速诱导表达,而在病理组织中整合素αvβ6同样被上调表达。IL-8促进肿瘤侵袭的确切具体机制以及其与整合素αvβ6的关系仍不是很清楚,比如IL-8与整合素αvβ6是否存在交互作用。在上述背景下,本研究拟在前期研究的基础上,通过收集临床结肠癌标本和临床病例随访,并选择结肠癌细胞细胞系,通过免疫组化、ELISA、质粒转染、qRT-PCR、RNA干扰等分子生物化学方法,在临床标本水平和细胞分子水平研究探讨IL-8与整合素avβ6在结肠癌迁移侵袭中的角色。第一部分IL-8和整合素αvβ6在结肠癌中的表达情况目的检测IL-8和整合素αvβ6在结肠癌中的表达情况,并初步探讨两者的表达之间是否存在相关性,以及其与临床病理因素之间的关系。方法收集2013年至2014年行根治性手术的结肠癌患者30例,于根治性手术结束后及时获取部分结肠癌组织及匹配的癌旁正常组织,通过qRT-PCR及Western blot检测结肠癌组织及癌旁正常组织中的IL-8的mRNA及蛋白表达水平。另随机选取2007年到2010年行根治性手术的结肠癌患者139例,通过免疫组化检测IL-8和整合素αvβ6的表达情况,分析IL-8和整合素αvβ6的表达与不同临床病理因素间的关系,并进一步利用Mann-Whitney统计学方法初步探讨IL-8和整合素αvβ6表达的相关性。检测具有不同转移潜能的结肠癌细胞HT-29、WiDr及Caco-2中IL-8和整合素αvβ6的蛋白表达情况。结果通过对在30例结肠癌患者行根治性手术过程中获取的结肠癌组织及与其匹配的癌旁正常组织进行qRT-PCR及Western blot检测发现,IL-8的mRNA及蛋白表达水平在结肠癌组织中明显高于癌旁正常组织。免疫组化检测139例原发性结肠癌标本发现,整合素αvβ6在58例结肠癌组织中表达,阳性表达率为41.7%,而且αvβ6的免疫染色主要位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞浆；IL-8在83例结肠癌组织中表达,阳性表达率为59.7%,而且IL-8的免疫染色主要位于肿瘤细胞和间质细胞的细胞浆。临床随访资料统计学分析表明,IL-8的表达与结肠癌的肿瘤病理分化程度(p=0.017)、临床M分期(p=0.004)以及TNM分期(p=0.007)相关,而整合素αvβ6的表达与结肠癌的临床N分期(p=0.041)、M分期(p=0.012)以及TNM分期(p=0.005)相关。Mann-Whitney统计学检验结果表明IL-8和整合素αvβ6的免疫组织化学表达之间存在着一定的相关性。IL-8和整合素β6亚基的蛋白表达水平在HT-29和WiDr中均较高,而在Caco-2中表达均较低；同时,通过对这三种细胞系的细胞外培养基提取物进行ELISA检测发现,HT-29和WiDr细胞系中的IL-8含量要明显高于Caco-2。结论1.IL-8的表达水平在结肠癌组织中明显高于癌旁正常组织,IL-8的表达与整合素avβ6的表达之间具有正相关性。2. 高转移潜能的结肠癌细胞HT-29和WiDr同时表达较高水平的IL-8和整合素αvβ6,而低转移潜能的结肠癌细胞Caco-2同时表达较低水平的IL-8和整合素αvβ6,间接支持IL-8与整合素αvβ6可能存在相关性。3. IL-8的表达与结肠癌的肿瘤病理分化程度、临床M分期以及TNM分期相关,整合素αvβ6的表达与结肠癌的临床N分期、M分期以及TNM分期相关,IL-8和整合素αvβ6与结肠癌的侵袭转移密切相关。第二部分IL-8对整合素αvβ6表达的影响目的明确IL-8对整合素αvβ6表达的影响。方法利用qRT-PCR和Western blot分别检测外源性或者内源性IL-8对整合素αvvβ6表达的影响；利用Western blot检测IL-8对ERK 1/2磷酸化和Ets-1活化的影响；利用MEK通路特异性抑制剂U0126或者Ets-1特异性siRNA研究ERK 1/2和Ets-1在IL-8调控整合素αvβ6表达过程中的作用。结果IL-8以浓度依赖性的方式上调HT-29及WiDr细胞中整合素β6亚基的mRNA及蛋白表达水平,并且CXCR1和CXCR2抗体可显著抑制该过程；shRNA技术干扰IL-8的表达后,p6亚基的表达降低。IL-8呈时间依赖性地促进ERK 1/2的磷酸化,MEK通路特异性抑制剂U0126可以显著抑制IL-8介导的ERK 1/2磷酸化及β6亚基的表达上调。IL-8可以促进Ets-1磷酸化水平的明显增加,而U0126可以显著抑制该过程,而且Ets-1特异性siRNA可显著抑制IL-8诱导的整合素αvβ6的表达上调。结论1.IL-8通过促进ERK 1/2的磷酸化,激活Ets-1对整合素αvβ6的转录,从而以浓度依赖性的方式诱导整合素αvβ6的表达。2. CXCR1和CXCR2参与IL-8上调整合素αvβ6表达的调控过程。第三部分αvβ6在IL-8介导的结肠癌细胞迁移侵袭中的作用目的明确整合素αvβ6在IL-8介导的结肠癌细胞迁移侵袭中的作用。方法通过细胞划痕、迁移及侵袭实验,检测IL-8在结肠癌细胞迁移侵袭中的作用。运用si-RNA及功能性抗体阻断技术,通过Transwell迁移实验检测整合素αvβ6在IL-8介导的结肠癌细胞迁移侵袭中的作用。分别用MEK通路特异性抑制剂U0126或PD98059、Ets-1特异性siRNA,检测ERK 1/2和Ets-1对IL-8介导的结肠癌细胞迁移侵袭的影响。结果IL-8以浓度依赖性的方式增加HT-29及WiDr细胞的迁移侵袭,且在IL-8刺激浓度为10ng/ml时达到最大效果,CXCR1和CXCR2抗体可显著抑制IL-8诱导的结肠癌细胞迁移过程。整合素αvβ6特异性siRNA或功能阻断抗体10D5预处理HT-29及WiDr细胞后均可显著抑制IL-8诱导的结肠癌细胞的迁移过程。MEK通路特异性抑制剂和Ets-1特异性siRNA均可显著抑制IL-8诱导的结肠癌细胞的迁移能力。结论1.IL-8通过诱导整合素αvβ6的表达上调,从而以浓度依赖性的方式促进结肠癌细胞的迁移侵袭。2.ERK 1/2和Ets-1通路参与IL-8对结肠癌细胞迁移侵袭的调控过程。3. CXCR1和CXCR2参与IL-8对结肠癌细胞迁移侵袭的调控过程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王毅;王芳;赵宏宇;王阳;周余来;原田守;山田亮;伊东恭悟;;前列腺酸性磷酸酶——结肠癌主动免疫治疗新靶点[J];中国老年学杂志;2008年18期

2 邵世和,谢立苹,霍龙;硒与结肠癌研究进展[J];北华大学学报(自然科学版);2003年05期

3 程文芳,顾晓红,钱伟,易粹琼;结肠癌中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体的表达[J];胃肠病学;2003年02期

4 郭艳丽,闫慧明,宋善俊;组织因子在结肠癌表达的临床意义(英文)[J];中国现代医学杂志;2005年15期

5 李建国;王双燕;沈若武;王守彪;;血管内皮生长因子与结肠癌的相关性研究[J];山东医药;2006年07期

6 孙军;沈磊;罗和生;沈志祥;;结肠癌瘦素和瘦素受体表达及其意义[J];中华消化杂志;2006年08期

7 宋e，

本文编号：2366819