【摘要】：乳腺癌是中国女性所患的恶性肿瘤中发病率最高的癌症。目前乳腺癌的综合治疗明显提高了乳腺癌的临床疗效,但很多病人仍因癌症的复发、转移和治疗抵抗而死亡。战胜乳腺癌,尤其是进展期乳腺癌的最终目标是克服治疗抵抗和避免癌症复发和转移。所以寻找乳腺癌的增殖、复发、转移及治疗抵抗等生物学特征的相关因素和机制成为首要任务。乳腺癌干细胞(BCSCs)是乳腺肿瘤中的一部分细胞群,具有干细胞特性,如自我更新、高度增殖和多向分化等。大量证据表明BCSCs是癌症复发、转移和治疗抵抗的原因。各种干细胞相关通路调控BCSCs的生物学功能。其中最主要的Wnt/β-catenin在乳腺癌组织,尤其在BCSCs中异常活化,能启动多种与乳腺癌起始、发展相关基因的表达,且是维持BCSCs增殖的关键因素。β-catenin是调节细胞附着或脱离的细胞动力学粘着连接的一个重要组成部分,既是Wnt信号通路的主要调控因子,又是细胞间联系的一种接合蛋白。实验证明诱导Wnt-l及β-catenin的高表达能提高小鼠乳腺肿瘤中BCSCs的比例。已发现β-catenin和其下游目标基因如cyclin D1和c-my在乳腺癌中异常表达。因此,特异性阻断BCSCs中Wnt/β-catenin和其相关基因对治疗乳腺癌具有重要价值。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是长度约22 nt的内源性短链RNA,可通过与目标m RNA的3’UTR互补结合后调节靶基因的翻译和表达。所以,micro RNA和编码结构性和调节性蛋白的目标m RNA所组成的复杂网络,调控个体发育、细胞分化、细胞增殖及凋亡以及肿瘤的形成。鉴于Wnt/β-catenin是BCSCs的重要调控途径,目前已发现一些micro RNA可通过抑制β-catenin的表达,调控Wnt/β-catenin活性,进而调节BCSCs。目前尚未见mi R-1对BCSCs中Wnt/β-catenin的调控研究。鉴于此,本课题研究mi R-1通过调控Wnt/β-catenin,影响BCSCs干细胞特性的作用机制以及乳腺癌相关基因与乳腺癌生物学行为的关系。具体工作如下:本实验首先通过mi RNA基因芯片研究了BCSCs和非CSC肿瘤细胞中与VI Wnt/β-catenin相关的mi RNA表达谱,得出相比于非CSC肿瘤细胞,在BCSCs中有14个mi RNAs表达上调,13个mi RNAs表达下调。其中mi R-1在BCSCs中低表达。然后通过定量RT-PCR分析了mi R-1在不同亚型乳腺癌组织及血清样本中的表达情况,发现mi R-1表达与乳腺癌的侵袭力呈负相关。为了进一步研究mi R-1在BCSCs的功能,我们在MCF-7和SKBR3细胞和其中分选出的CSCs中转染mi R-1mimic和mi R-1inhibitor,增强或抑制mi R-1的表达。流式细胞仪分析发现MCF-7和SKBR3细胞中,增强mi R-1的表达降低了SKBR3/CSCs的百分比,抑制mi R-1的表达增加了MCF-7/CSCs的百分比,可见mi R-1的过表达降低了乳腺癌细胞系中CSC的比例。mi R-1在Wnt/β-catenin中的可能目标用生物信息分析和荧光素酶分析明确。双荧光素酶报告基因检测和western blot结果表明,增强mi R-1的表达明显减少了293T细胞中Frizzled 7、TNKS2(Tankyrase-2)调控的荧光素酶活性,并降低了体外BCSCs中Frizzled7,TNKS2,c-Myc,Oct4(Octamer Binding Transcription Factor 4)和Nanog的表达,同时降低了β-catenin的核质比和β-catenin-依赖的萤光素活性,明确了mi R-1抑制Wnt/β-catenin,从而降低BCSCs的干细胞性。细胞增殖和迁移实验明确mi R-1抑制体外乳腺肿瘤干细胞的增殖,迁移能力。移植瘤乳腺癌模型显示增强mi R-1的表达抑制了植入MCF-7/CSCs的生长,而抑制mi R-1的表达促进了体内植入MCF-7/CSCs的生长。这些数据(实验研究1.1)表明,mi R-1通过靶向Frizzled 7及TNKS2抑制了Wnt/β-catenin,从而下调了BCSCs的干细胞性、增殖和迁移。鉴于BCSCs是乳腺癌发生,复发和转移的根源,基于mi R-1的阻断疗法有望在预防和阻断乳腺癌的复发和转移中起到重要作用。我们进一步研究了Wnt/β-catenin关键因子β-catenin、cyclin D1、c-myc表达与乳腺癌生物学行为的相关性(实验研究1.2)。发现乳腺癌组的β-catenin异常表达率、cyclin D1和c-myc阳性表达率均明显高于乳腺增生组的对应指标。淋巴结转移与cyclin D1、c-myc的表达有关。乳腺癌β-catenin异常表达,与cyclin D1和c-myc阳性表达有相关。Western blot检测方法明确与乳腺癌增生组织相比,乳腺癌组织、乳腺癌细胞质和细胞核中的β-catenin表达水平明显升高,乳腺癌组织细胞核中β-catenin的蛋白水平高于细胞质。这些数据提示乳腺癌的发生可能与β-catenin异常表达,cyclin D1和c-myc阳性表达有关,并且cyclin D1、c-myc可能被β-catenin激活。Lipase member H蛋白与Wnt/β-catenin一样是重要的肿瘤调控因素。在人类中Lipase member H蛋白是LIPH基因编码的酶,参与多种生物学过程,包括血小板凝集,平滑肌收缩,细胞增殖的刺激。虽现有研究发现LIPH m RNA在肠、肺和胰腺特异性表达,但在乳腺癌中的表达尚不明确。我们研究了Lipase member H与乳腺癌生物学行为的关系(实验研究1.3),寻找阻断乳腺癌增殖的新靶点。发现与癌旁组织相比,乳腺癌组织高表达Lipase member H蛋白,明显相关于组织学分级,淋巴结转移和术后远处转移。进一步分析后Lipase member H蛋白的表达被认定为是乳腺癌的独立预后因子。表明Lipase member H蛋白的表达是不良预后预测因素,Lipase member H蛋白有望成为乳腺癌的治疗目标。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：2369761
