多不饱和脂肪酸对前列腺癌细胞的促凋亡机制的研究

发布时间：2018-12-11 20:27

【摘要】：前列腺癌(prostitic cancer)是男性癌症患者的主要死亡原因之一,严重危害男性生活质量和生命健康。目前,临床上对于前列腺癌症患者的诊断和治疗,仍缺乏更为科学有效的方法。临床上对前列腺癌症患者的诊断,主要依靠癌组织病理形态学的Gleason分级评分,作为判断前列腺癌症患者,实施何种治疗方案和推测其预后的标准。另外,前列腺癌的病理学改变复杂,准确鉴别并分级难度较大。因此,复合ELISA等方法,也是前列腺癌的辅助诊断依据。近期研究表明,前列腺的原生腺体组织和周围间质组织,在癌症的发生和发展中起到重要作用。灰度熵矩阵(GLEM)纹理分析是一种新的图像分析,用来评价和研究胞外间质取向的变化,有其独特的优越性。能否利用GLEM辅助分期分型诊断前列腺癌是本研究的内容之一。目前,临床上预防和治疗前列腺癌,传统的治疗方案就是雄激素剥夺治疗(androgen deprition treatment,ADT),包括药物抗雄激素以及手术去势,以阻止雄激素结合到雄激素受体上的方式,抑制肿瘤的生长。这一方案至今仍是前列腺癌的主要治疗手段。然而,传统的抗雄治疗,并不能完全抑制前列腺癌的进程,大多数前列腺癌症患者,在经过ADT治疗之后,都会以非激素依赖的方式复发。深海鱼油,其主要成分是n-3系多不饱和脂肪酸(n-3 Polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFA)中的DHA(docosahexaenoic acid;C22:6n-3)和EPA(eicosapentaenoic acid;C20:5n-3)。近年来,国内外多项人群调查和meta分析表明,饮食中增加n-3 PUFA的摄入,有可能降低前列腺癌的发病风险。那么,n-3系多不饱和脂肪酸,在细胞水平能否直接影响前列腺癌细胞,发挥抗癌的作用呢?为了解决上述问题,本研究以临床前列腺癌症患者和前列腺癌细胞系作为研究对象,进行以下三部分研究:1)对比复合ELISA方法,利用GLEM纹理分析方法,检测患者的前列腺腺癌反应性间质和转移潜能;2)利用n-3系多不饱和脂肪酸处理前列腺癌细胞,观察何种n-3 PUFA能够影响前列腺癌细胞的生长;3)n-3系多不饱和脂肪酸DHA如何改变基因表达,促进前列腺癌细胞的凋亡。通过上述三个部分的研究,为临床辅助分期分型诊断前列腺癌,饮食补充n-3pufa预防和治疗前列腺癌,提供实验依据和理论基础。第一部分灰度熵矩阵法glem在临床检测高级别前列腺腺癌反应性间质和转移潜能的可行性分析目的:对比研究复合elisa和灰度熵矩阵(glem)纹理分析,评价能否通过glem判断前列腺癌细胞外间质取向的变化(即反应性间质)和转移潜能。方法:1收集前列腺癌症患者的标本,观察病理改变并进行核密度分析。2灰度熵矩阵glem对样本进行纹理分析。3利用复合elisa方法综合评价各前列腺癌组织样本。结果:1组织形态学和核密度分析he染色可见良性前列腺增生(bph),是以基底细胞的增生肥大为主要特点,基底细胞多为立方形和矮柱状,平滑肌细胞粗大、密集,弥散地分布于间质中,细胞核形态未有明显异常变化;与bph相比,晚期前列腺腺癌(pa)的基底细胞结构异常紊乱,细胞核深染、颗粒数量增多但大小不一,与核密度分析显示的结果一致(p0.05)。2灰度熵矩阵glem纹理分析利用专业图像处理软件,突出了间质组织的信号,可见bph的间质所占比例较高,间质的结构成分发生变化,平滑肌占间质的面积增加;与bph相比,晚期pa和治疗不敏感pa的间质组织结构紊乱,间质细胞形态各异。进一步分析显示,与正常前列腺和bph相比,晚期pa和治疗不敏感pa的相邻像素间,对比度(neighboringpixelscontrast)缺失明显,同样提示间质细胞排列紊乱,间质组织结构异常。灰度熵矩阵glem纹理分析结果表明,各种前列腺样本的纹理参数即异质性缺失(lossofheterogeneity)的差异,较相邻像素间对比度更为明显。高度紊乱的基质结构,往往提示着恶性分级更高的前列腺肿瘤。在各样本中,良性前列腺增生样本的熵值最低(p0.05),而非雄激素依赖性前列腺癌组织样本的熵值最高(p0.05),熵值的高低代表了图像中反应性基质的多少。3复合elisa分析用复合elisa方法,将各个血清前列腺癌特异抗原(其中vegf代表新生血管基因,beta1-integrin、e-cadherin和mmp3代表e-m转换相关基因,rankl和osteoprotegerin代表恶性转化相关基因)的检测结果,进行相关性分析发现,各癌性前列腺组织样本与良性前列腺增生样本单独进行比较,有统计学意义;将五种样本一起比较分析后,其组间差异则无统计学意义。结论:复合elisa方法仅能判断前列腺组织样本的良、恶性,不能进一步辅助前列腺癌的分期分级。灰度熵矩阵glem纹理分析,可以通过熵值分析间接反映前列腺癌组织反应性基质的数量,可辅助前列腺疾病的诊断和分期分级。第二部分多不饱和脂肪酸pufa对前列腺癌细胞的促凋亡作用目的:检测深海鱼油、n-3pufa中的epa和dha、n-6pufa中的花生四烯酸(aa),对良性前列腺细胞和不同前列腺癌细胞的影响,在细胞水平研究哪些pufa能够抑制前列腺癌细胞的生长,为临床应用pufa预防和治疗前列腺癌提供实验依据。方法:1采用mtt方法,检测fishoil、epa、dha和aa对前列腺细胞和前列腺癌细胞生存率的影响。2应用westernblot和rtreal-timepcr,检测caspase3的基因表达水平。3通过hochest33258染色,观察凋亡细胞的细胞核改变。结果:1深海鱼油fishoil降低前列腺癌细胞的生存率与bsa对照组相比,不同浓度fishoil刺激pcs-440-010良性前列腺细胞24小时后,没有影响其生存率;不同浓度fishoil刺激pc3和du145前列腺癌细胞24小时后,两种癌细胞生存率明显下降(p0.05);不同浓度fishoil刺激lncap前列腺癌细胞24小时后,没有影响其生存率。2epa、dha和aa对前列腺癌细胞生存率的影响分别给予n-3pufa中的epa和dha刺激24小时,均可以明显降低pc3和du145前列腺癌细胞的生存率(p0.05)。给予不同浓度的n-6系多不饱和脂肪酸aa刺激24小时,对du145前列腺癌细胞的生存率没有影响。给予dha50μm分别刺激du145前列腺癌细胞12,24,48,72小时后发现,du145生存率与dha刺激呈时间依赖性。3dha促进前列腺癌细胞du145的caspase3表达并诱发细胞凋亡与bsa对照组相比,不同浓度dha刺激前列腺癌细胞du14524小时后发现,caspase3的mrna水平明显增高,呈浓度依赖性(p0.05);不同浓度dha刺激前列腺癌细胞du14524小时后发现,caspase3的蛋白质水平明显增高;hochest33258染色结果显示,dha50μm处理du145前列腺癌细胞24小时后,可见细胞核染色变深,且多处细胞核呈碎块状且致密浓染。结论:深海鱼油能够降低前列腺癌细胞的生存率,然而,对良性前列腺细胞无此影响。n-3系多不饱和脂肪酸dha能够呈浓度、时间依赖性降低前列腺癌细胞du145的生存率。dha通过诱导caspase3表达增加,导致前列腺癌细胞du145发生凋亡,降低其生存率。第三部分dha诱导前列腺癌细胞凋亡的信号通路研究目的:利用能够同时检测84个凋亡通路相关基因的rt2profilerpcrarrays方法,进一步用定量pcr进行验证,探索dha如何改变凋亡信号通路,引起前列腺癌细胞凋亡,为临床应用dha防治前列腺癌,提供科学依据和理论基础。方法:1利用rt2profilerarray-apoptosis方法,寻找dha诱导前列腺癌细胞凋亡的作用靶点。2利用rtreal-timepcr方法,验证和筛选结果。结果:1dha引起前列腺癌细胞du145凋亡信号通路的激活1.1rt2profilerarray方法筛选结果应用rt2profilerarray-apoptosis方法,对84个凋亡相关基因mrna水平进行检测,结果表明,dha50μm处理du145前列腺癌细胞24小时后,凋亡信号通路中共有10个基因表达上调且大于等于2倍,5个基因表达下调且小于等于0.5倍。与bsa处理的对照组相比,dha处理24小时后,du145细胞caspase家族中的caspase1,caspase3和caspase9转录水平,分别上调了2.06,4.88和12.10倍;促细胞凋亡的bax基因上调了2.93倍,并且bax与bcl2比值增加;细胞死亡诱导相关基因cidea和dffa,分别上调了2.34和3.21倍;肿瘤坏死因子相关基因lta和tnf,分别上调了2.04和2.24倍;基因警察tp53的mrna表达上调了2.97倍。另外,与bsa处理的对照组相比,dha处理24小时后,du145细胞线粒体相关凋亡诱导基因aifm1,蛋白激酶akt1,bh3位点死亡诱导基因bid和birc6,x连锁凋亡抑制蛋白xiap转录水平的表达,均发生下调。1.2rtreal-timepcr方法验证和筛选结果不同浓度dha刺激24小时后,在前列腺癌du145细胞caspase家族中,caspase1、caspase3、caspase9和caspase12,表达均明显增加,其中caspase3、caspase9和caspase12的表达,与dha刺激浓度有剂量依赖性关系;前列腺癌du145细胞bax、cidea、dffa、tnf和tp53基因表达,均明显增加;其中bax、cidea和tnf的表达,与dha刺激浓度有剂量依赖性关系;前列腺癌du145细胞aifm1、akt1、bid、birc6和xiap基因表达,均明显下降;其中aifm1、bid和xiap的表达,与dha刺激浓度有剂量依赖性关系。结论:dha通过改变caspase家族等凋亡信号通路相关基因的表达,诱导前列腺癌细胞发生凋亡。小结:1应用灰度熵矩阵glem纹理分析,可以通过熵值分析间接反映前列腺癌组织反应性基质的数量,有助于前列腺疾病的诊断和分期分型。2鱼油中n-3系多不饱和脂肪酸(dha),能够诱导前列腺癌细胞发生凋亡,对正常前列腺癌细胞无此作用。3 DHA可能通过改变Caspase家族等凋亡信号通路相关基因的表达,诱导前列腺癌细胞发生凋亡。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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