【摘要】：研究背景:叉头框转录因子F2(forkhead box F2,FOXF2)属于间质特异性转录因子,通过调节细胞极性维持组织稳态,在胚胎发育和组织分化过程中发挥关键作用。本课题组前期研究发现,FOXF2在基底细胞样乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)中特异性表达;FOXF2低表达通过诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)而促进BLBC转移,但却抑制癌细胞增殖。多项研究证实FOXF2在其他肿瘤的发生和发展中也发挥着重要作用,但是调控肿瘤中FOXF2特异性表达的分子机制未见报道。我们通过生物信息学分析FOXF2近端启动子的DNA序列,发现其启动子上存在一个Cp G岛,且Cp G岛中存在多个转录因子SP1的潜在结合位点。因此,我们推测DNA甲基化和转录因子SP1协同调节FOXF2在不同乳腺癌细胞亚型中表达及其在乳腺癌增殖和转移中的作用。目的本研究旨在阐明DNA甲基化通过抑制转录因子SP1与FOXF2启动子的结合而调控FOXF2在不同乳腺癌细胞亚型中表达的分子机制,以及其在FOXF2介导的SP1调控乳腺癌细胞转移和增殖中的作用。研究方法:1、采用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)方法检测luminal亚型乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-453、basal-like亚型乳腺癌细胞系MDA-MB-231和永生化乳腺上皮细胞系MCF-10A、以及20例乳腺原发癌组织中FOXF2启动子区的甲基化程度。同时,采用RT-QPCR方法检测乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中FOXF2 m RNA的表达水平,Western blot方法检测乳腺癌细胞中FOXF2蛋白的表达水平。分析FOXF2启动子的甲基化程度与其表达水平的相关性。2、为了研究DNA甲基化对FOXF2表达的影响,分别用浓度梯度为0、0.5、1、1.5、2和2.5μM的DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-aza-d C)作用于乳腺癌细胞,然后通过RT-QPCR和Western blot方法检测FOXF2表达水平的改变。3、为了研究细胞内甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)对FOXF2表达的调节作用,分别采用小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)沉默FOXF2启动子高甲基化的MCF-7和MDA-MB-453细胞中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达,然后通过RT-QPCR和Western blot方法检测FOXF2表达的变化。同时,通过染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecitation,Ch IP)实验验证MCF-7和MDA-MB-453细胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B与甲基化的FOXF2启动子的结合。4、为了研究DNA甲基化是否可以直接抑制FOXF2启动子的活性,分别用甲基转移酶Sss I,Hha I和Hpa II体外催化FOXF2启动子 655 bp至+128 bp的区域发生不同程度的甲基化修饰,然后克隆入p GL3-basic载体,并转染MDA-MB-231细胞,最后采用双荧光素酶报告系统检测不同甲基化程度的FOXF2启动子的转录活性。5、分别采用Ch IP和双荧光素酶报告系统实验验证SP1对FOXF2启动子的结合和转录激活作用;为了分析SP1对FOXF2表达的调节作用,在MDA-MB-231和MCF-10A细胞中分别转染SP1真核表达载体(SP1)或SP1si RNA(si SP1),以及采用SP1特异性抑制剂光辉霉素(Mithramycin,MTM)处理MDA-MB-231和MCF-10A细胞,然后通过RT-QPCR和Western blot方法检测FOXF2表达的变化。6、为了研究DNA甲基化对SP1转录激活FOXF2启动子活性的影响,用2μM的5-aza-d C处理MCF-7细胞,然后通过Ch IP实验检测SP1与FOXF2启动子的结合能力的变化;SP1与不同甲基化状态的FOXF2启动子荧光报告质粒共转染MDA-MB-231后,采用双荧光素酶报告系统检测SP1对不同甲基化程度的FOXF2启动子的转录激活作用。7、为了研究FOXF2介导SP1对乳腺癌细胞生物学行为的调控作用,分别在过表达SP1的MDA-MB-231细胞中降表达FOXF2,或在降表达SP1的MCF-10A细胞中过表达FOXF2,然后通过体外Transwell和MTT实验评价乳腺癌细胞生物学行为的改变,并采用Western blot方法检测乳腺癌细胞中SP1、FOXF2和FOXF2靶基因TWIST1的表达。8、为了研究SP1-FOXF2通路对不同亚型乳腺癌转移的影响,我们基于GEO(gene expression omnibus)基因表达数据库中一组427例乳腺癌患者的数据资料(登记号GSE25066),分别统计分析luminal亚型和Basal-like亚型乳腺癌患者中SP1(probe set No.214732_at)和FOXF2(probe set No.206377_at)m RNA的表达水平与无远处转移生存(distant metastasis free survival,DMFS)的关系。结果:1、Basal-like亚型的MDA-MB-231和MCF-10A细胞中,FOXF2启动子的甲基化程度低于luminal亚型的MCF-7和MDA-MB-453细胞,而MDA-MB-231和MCF-10A细胞中FOXF2 m RNA和蛋白表达水平高于MCF-7和MDA-MB-453细胞。基于FOXF2 m RNA水平将20例乳腺癌组织分为FOXF2高表达组(FOXF2high;n=10)和FOXF2低表达组(FOXF2low;n=10),FOXF2high组中FOXF2启动子的甲基化程度显著低于FOXF2low组(P=0.027)。证实乳腺癌中FOXF2启动子的甲基化程度与其表达水平呈负相关。2、在5-aza-d C处理的MCF-7和MDA-MB-453细胞中,FOXF2启动子的甲基化程度显著降低,FOXF2的表达水平随着5-aza-d C浓度的增加而升高;在5-aza-d C处理的MDA-MB-231和MCF-10A细胞中,FOXF2的表达水平无明显变化。证实乳腺癌中FOXF2启动子的甲基化是抑制其表达的重要因素。3、在MCF-7细胞中降表达DNMT1或DNMT3A可以上调FOXF2表达水平,而降表达DNMT3B对其表达水平没有影响;在MDA-MB-453细胞中降表达DNMT1或DNMT3B可以上调FOXF2表达水平,而降表达DNMT3A对其表达水平没有影响。Ch IP实验证明MCF-7细胞中DNMT1和DNMT3A与FOXF2启动子的Cp G岛结合,而DNMT3B的结合十分微弱;MDA-MB-453细胞中DNMT1和DNMT3A与FOXF2启动子的Cp G岛结合,而DNMT3B的结合十分微弱。证实不同的乳腺癌细胞系中DNMTs对FOXF2的表达抑制作用不同。4、双荧光素酶报告系统结果显示,没有甲基化的FOXF2启动子活性最高,甲基转移酶Hha I和Hpa II催化的部分甲基化的FOXF2启动子活性次之,而甲基转移酶Sss I催化的完全甲基化的FOXF2启动子的活性最低。证实DNA甲基化可以直接抑制FOXF2启动子的转录活性。5、Ch IP实验证明SP1可以与FOXF2启动子区结合;双荧光素酶报告系统证实SP1可以增强FOXF2启动子的转录活性;在FOXF2启动子低甲基化的MDA-MB-231和MCF-10A细胞中分别降表达或过表达SP1,FOXF2的表达也随之降低或升高;MTM处理MDA-MB-231和MCF-10A细胞后,FOXF2的表达水平随着MTM浓度的升高而降低。证实SP1转录促进FOXF2启动子低甲基化的乳腺癌细胞中FOXF2的表达。6、5-aza-d C处理MCF-7细胞后,Ch IP实验证明SP1与FOXF2启动子区的结合能力增强。双荧光素酶报告系统结果显示过表达SP1对完全甲基化的FOXF2启动子的转录活性没有影响,但可以增强无甲基化和部分甲基化的FOXF2启动子的转录活性。证实DNA甲基化抑制SP1对FOXF2启动子的转录激活。7、过表达SP1可以降低MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力,下调FOXF2的靶基因TWIST1的表达水平,但增强细胞增殖能力,而降表达FOXF2可以逆转过表达SP1所导致的细胞生物学行为的改变;降表达SP1可以增强MCF-10A细胞的迁移和侵袭能力,上调TWIST1的表达水平,但降低细胞增殖能力,而过表达FOXF2可以逆转降表达SP1所导致的细胞生物学行为的改变。证实FOXF2介导SP1对乳腺癌细胞生物学行为的调控作用。8、根据FOXF2和SP1 m RNA的表达水平将427例病人分为SP1high/FOXF2high组(n=111),SP1low/FOXF2high组(n=65),SP1high/FOXF2low组(n=154)和SP1low/FOXF2low组(n=97)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,在basal-like亚型的乳腺癌患者中SP1low/FOXF2low组患者的无远处转移生存率比其他三组患者低(P=0.0018),在luminal亚型的乳腺癌患者中四组患者的无远处转移生存率没有统计学差异。证实SP1-FOXF2通路参与basal-like亚型乳腺癌的转移,而与luminal亚型乳腺癌的转移无关。结论:1、在乳腺癌中,DNA甲基化调控FOXF2在不同乳腺癌细胞亚型中表达。2、SP1转录激活FOXF2启动子的活性,而这种转录激活被DNA甲基化所抑制。3、在FOXF2启动子低甲基化的basal-like亚型乳腺癌细胞中,SP1促进FOXF2的表达,同时FOXF2介导SP1对乳腺癌细胞转移和增殖的影响。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【共引文献】
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2378826
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