重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERT-E1a对结肠癌抑制作用的实验研究

发布时间：2018-12-16 17:50

【摘要】：结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,据国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer)资料显示,全球结直肠癌新发病例在男性中发病率位居恶性肿瘤第3位,女性患者仅次于乳腺癌而位居第2位。我国结肠癌发病率位于肺癌、胃癌、肝癌和乳腺癌之后,居第5位。尽管在肿瘤防治以及手术、放疗、化疗等治疗策略上都有进步,这些仅限于在初期肿瘤的治疗中有较满意的疗效,而在晚期多无法获得根治。目前临床迫切需求新型的更有效的治疗手段进入临床应用。在肿瘤研究领域,基因治疗是一项有潜力的逆转常规放化疗抵抗的研究热点之一。然而,基因治疗的有效性及其特异性仍存在诸多挑战。溶瘤病毒能够特异性识别肿瘤细胞并具备复制能力,通过直接溶瘤而杀伤肿瘤细胞。此外,溶瘤病毒还可以通过基因修饰等分子工程的操作,携带各种肿瘤特异治疗元件产生抗肿瘤免疫等多种作用发挥抗癌效应。这种将肿瘤的病毒治疗与基因治疗结合起来的方法,利用溶瘤病毒选择性在肿瘤细胞内的增殖与复制,增加溶瘤病毒携带的抗癌基因的拷贝数量,提高其表达水平,从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。因此,溶瘤病毒为强效且特异选择性杀伤的极具潜力的抗肿瘤方法之一。基于腺病毒的载体是基因转移最广泛应用的平台之一。然而,非复制潜能的腺病毒极少可以有效地清除肿瘤细胞。因此,需要极大的浓度或剂量以达到较有效的抗肿瘤反应;但是往往诱导宿主抗病毒免疫反应,导致病毒载体在随后的组织免疫与毒性反应过程中被中和,而失去治疗作用。为克服这些局限,条件性复制潜能的腺病毒被开发而广泛检测评估,这一系列的病毒可特异性地在肿瘤细胞内复制,随后溶解肿瘤细胞并释放子代病毒,继续感染并杀伤邻近的肿瘤细胞。近年来的研究证实,可与有复制潜能的腺病毒中和的抗体实际上对这些腺病毒作用有限,因此可以推测,肿瘤特异选择性复制潜能的腺病毒在肿瘤基因治疗中极为有效。在本研究中,已应用肿瘤特异启动子人端粒酶逆转录酶(h TERT)以及肿瘤细胞选择性凋亡诱导基因凋亡素(Apoptin)构建了重组溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a,并已经在一系列的不同类型肿瘤细胞中如胃癌、前列腺癌中呈现出强效的抗肿瘤生长与抑制肿瘤转移的疗效。端粒酶活性在大约90%以上的肿瘤组织内过表达,而在正常组织内无法测出,因其肿瘤特异性强而作为肿瘤标志物被广为应用。在端粒酶亚型中,h TERT决定永生化细胞以及85%以上人类肿瘤细胞的端粒酶活性。因此,h TERT启动子已通过转基因操作而达到肿瘤特异表达的效应。另一方面,Apoptin是鸡贫血病毒的VP3基因表达的产物,对一系列转化或人源性恶性肿瘤包括肝癌,淋巴瘤,胆管癌,黑色素瘤以及乳腺、肺与结肠癌中呈现出特异性与有效性,而对非转化细胞包括成纤维细胞、角质细胞或平滑肌细胞则无促凋亡作用,因此认为,Apoptin是一较特异的肿瘤促凋亡蛋白。目前尚无Ad-Apoptin-h TERT-E1a对结肠癌抑制作用效果的研究,本研究通过系列的体外及体内实验,以检测Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP等重组腺病毒对肿瘤组织的靶向作用,探讨AdApoptin-h TERT-E1a抑制肿瘤生长并促进其凋亡的疗效。实验目的本实验拟研究Ad-Apoptin-h TERT-E1a对结肠癌细胞特异性杀伤作用,并探讨Ad-Apoptin-h TERT-E1a的抑瘤率、对结肠癌细胞的抑制作用方式及其作用机制。实验方法体外实验中,以正常胃粘膜细胞系GES为对照组,重组腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP分别感染人结肠癌细胞SW1116,通过MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式细胞术明确重组腺病毒的靶向作用及抑制作用方式。同时,以Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP不同重组腺病毒为对照组,通过MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式细胞术明确Ad-Apoptin-h TERT-E1a对结肠癌细胞的抑制作用效果。此后,通过Western blot检测及流式细胞仪检测Caspase酶、活性氧(ROS)和线粒体膜电位(MMP)水平,进一步检测抑制效应的相关机制,从分子水平对重组腺病毒的抑瘤途径进行研究。在体内实验中,利用鼠结肠癌CT26细胞分别构建BALB/c小鼠实体荷瘤模型及肺转移荷瘤模型,经皮下注射及尾静脉注射两种方式接种重组腺病毒,通过观察肿瘤生长趋势、不同时间的抑瘤率、生存期探讨Ad-Apoptin-h TERT-E1a的体内抑瘤作用效果。实验结果通过MTT染色、光镜检测、AO/EB染色以及Annexin V染色等检测,结果显示重组腺病毒可不同程度诱导细胞凋亡,其中,Ad-Apoptin-h TERT-E1a对人结肠癌细胞SW1116的诱导凋亡作用最强,而各重组腺病毒均对正常细胞系GES未见明显抑制作用。MTT染色还表明,相对定量分析,Ad-Apoptin-h TERT-E1a对体外培养的SW1116的抑瘤作用呈现出一定的剂量依赖效应以及时间依赖效应。Western blot检测及流式细胞仪检测caspase 3,caspase 6及caspase 7等凋亡执行蛋白的表达水平变化,同时检测此过程中线粒体膜电位、活性氧以及细胞色素酶C的变化。结果表明,在Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116细胞中,Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7凋亡执行蛋白的活性明显增强,并伴有ROS、MMP及Cyto C的变化。结果提示,Ad-Apoptin-h TERT-E1a诱导人结肠癌细胞凋亡的作用机制之一为通过影响线粒体膜电位而启动内源性激活凋亡信号通路,而对正常的胃粘膜细胞GES并产生影响。对两种荷瘤模型的体内治疗实验结果显示,接种Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin等重组腺病毒瘤内注射或血管用药,均可以明显的抑制小鼠体内接种的肿瘤的增殖,并显著地延长小鼠模型的生存期,且未见明显的毒副作用,其中Ad-Apoptin-h TERT-E1a T作用最强。进一步验证了重组溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。结论h TERT启动子调控的表达Apoptin基因的溶瘤腺病毒,即Ad-Apoptin-h TERT-E1a可使大多数SW1116肿瘤细胞表现为凋亡形态,这种诱导凋亡的作用呈现出典型的剂量依赖的特征以及时间依赖特征。Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116细胞中,Caspase-3/6/7凋亡相关蛋白的活性明显增强,线粒体膜电位水平下调,而活性氧水平及Cyto C水平上调,提示Ad-Apoptin-h TERT-E1a可能通过线粒体途径诱导人结直肠癌细胞凋亡、抑制其增殖。Ad-Apoptin-h TERT-E1a的这种诱导肿瘤细胞凋亡的抑瘤作用具有特异的肿瘤细胞靶向性,对正常细胞无诱导凋亡作用。Ad-Apoptin-h TERT-E1a显著地抑制了小鼠体内接种肿瘤的增殖,同时可延长CT26荷瘤小鼠模型的生存时间,而未见明显的毒副反应。综上所述,Ad-Apoptin-h TERT-E1a呈现出应用于抗肿瘤治疗的潜力,可同时应用于原发性与转移性结肠癌的治疗。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35

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