靶向封闭AKT1抑制肝癌细胞增殖和迁移的研究

发布时间：2018-12-20 07:29

【摘要】：目的:超过90%的原发性肝癌为肝细胞癌(HCC),HCC的预后较差。虽然手术治疗仍是迄今为止最有效的治疗,但大多数HCC患者被诊断时处于晚期,不能接受手术治疗,而未经治疗的患者5年存活率仅为5%。因此,探索HCC新的治疗靶点以发掘HCC新的有效可行的治疗方法是至关重要的。PI3K/AKT/m TOR信号通路已经被越来越多的研究证明其在HCC的发生和发展中起关键作用。AKT是PI3K/AKT/m TOR信号通路的重要桥梁点,已经有证据表明其对调节细胞活力信号方面起重要作用,并且与各种增殖性疾病密切相关。许多数据表明,单一AKT的亚型(即AKT1,AKT2和AKT3)在调节癌细胞增殖、迁移和侵袭中具有不同甚至相反的功能。AKT同种异型可能对癌症传播具有不利影响。AKT家族,也叫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,特别是AKT1亚型已被确定在HCC细胞中异常表达,并且与细胞行为(包括增殖,存活,代谢和肿瘤发生)高度相关。然而,AKT1的调节具体机制需要进一步研究。我们的研究的目的是揭示AKT1对HCC细胞增殖和迁移的影响,并调查其所涉及的机制。方法:用TRIzol试剂从HCC细胞(SMMC-7721,HepG2)中提取总RNA,SYBR Premix Ex Taq试剂对c DNA样品进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测基因的表达。我们使用RT-PCR来评估两个HCC细胞系(SMMC-7721和Hep G2)中AKT1的表达水平。按照质粒提取试剂盒说明书提取空白质粒和AKT1-RNAi质粒。提取出来的质粒用Effectene转染试剂进行转染。转染48小时后,用PT-PCR检测转染效率。Western blot用来检测AKT1对分子蛋白调节机制的影响,MTT法检测AKT1的表达对HCC细胞生长增殖的影响,细胞划痕实验用来检测SMMC-7721和Hep G2细胞的迁移能力。所有实验重复三次。结果:与正常肝细胞系HL-7702中的表达水平相比,SMMC-7721和HepG2肝癌细胞系中AKT1的表达明显显著上调(**p0.01)。然后我们评估了下调质粒(AKT1-RNAi质粒)的转染效率。相应结果是下调质粒抑制了AKT1的表达,表明转染有效。进行MTT测定以了解AKT1在HCC细胞增殖中的作用,结果显示AKT1-RNAi质粒下调AKT1的表达可抑制细胞增殖(p0.05)。AKT1-RNAi质粒转染的SMMC-7721和Hep G2细胞的伤口愈合的能力明显显著降低(**p0.01)。此外,封闭AKT1后可通过抑制NF-κB的转录激活和下调MMP-2、MMP-9的活性和表达来抑制HCC细胞系的增殖和迁移。(**p0.01)。在Western免疫印迹实验中,与空白质粒转染的细胞相比,敲除AKT1蛋白对NF-κB、MMP-2和MMP-9表达有明显的影响。相于空白质粒转染细胞,AKT1-RNAi质粒转染细胞MMP-2和MMP-9活性较低(**p0.01)。与此同时,我们发现,在HCC细胞中下调AKT1抑制了其介导的NF-κB的表达和分泌(**p0.01)。结论:我们的研究结果显示AKT1在HCC细胞系的增殖和迁移中起重要作用。阻断AKT1能抑制NF-κB的表达水平和肝癌的发展。我们的结果表明了沉默AKT1表达可能通过抑制SMMC-7721和Hep G2细胞中的NF-κB的激活下调MMP-2、MMP-9的表达水平和催化活性,从而抑制肝癌细胞的增殖及迁移。靶向封闭AKT1后,抑制了肝癌细胞的增殖及迁移,因此以它作为肿瘤的靶标具有潜在的应用价值。
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【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】