DNA稳定银纳米簇的合成及其DNA和肿瘤细胞的免标记检测研究

发布时间：2018-12-28 11:39

【摘要】：金属纳米簇(metal nanoclusters)是一类由数个到数十个原子组成,结构介于单金属原子和纳米颗粒之间的金属纳米团簇,它的独特结构赋予其荧光量子产率高、荧光稳定性好等优越的荧光性质,同时也具有生物毒性低、水溶性好等优势,这些特性使得金属纳米簇作为一类新型免标记荧光材料在荧光分析和荧光成像等领域得到广泛的关注和研究。其中,利用DNA为模板合成的银纳米簇荧光性质优良,通过改变DNA序列可产生可见到近红外区间荧光发射带的不同银纳米簇,引起了科研工作者特别的重视。利用银纳米簇模板DNA本身是核酸的属性,很多可用来操控核酸的工具酶也可以引入到这种免标记的荧光探针中来。基于DNA分子与不同靶标的特异识别能力(如核酸碱基互补配对结合,核酸适体与目标物的结合等),这种免标记的荧光探针也可用于核酸、离子、小分子、蛋白质、甚至细胞的检测。基于此,本论文以DNA稳定的银纳米簇为研究对象,一方面利用其荧光作为信号来源,结合核酸工具酶放大技术将其应用于核酸的免标记灵敏检测；另一方面,通过合成模板序列的优化,筛选出一条可高效合成银纳米簇的DNA模板,并通过在DNA模板上延长一段肿瘤细胞的aptamer序列,进一步将其运用于肿瘤细胞的免标记检测。主要研究内容如下：一、基于DNA稳定的荧光银纳米簇结合核酸外切酶Ⅲ辅助的信号放大用于DNA的免标记检测研究DNA稳定的荧光银纳米簇因具备合成简便、成本低廉、荧光强度大及荧光稳定性好等优点,常被用于构建免标记的荧光分子探针；然而,其合成需要高浓度DNA模板(微摩尔)使得基于银纳米簇的分析方法检测灵敏度受限。利用银纳米模板是核酸的特性,结合一些核酸工具酶辅助的信号放大技术,能够有效地克服该缺陷。在本工作中,基于银纳米簇对DNA模板构型和序列的依赖性及外切酶Ⅲ辅助的信号放大作用,我们发展了一种免标记、灵敏的核酸检测方法。在本方法中,我们设计了两个核酸探针,一个是包含银纳米簇合成模板的3’突出发夹序列(HP)；一个是含有能打开HP的3’突出双链序列(P/HB)。当靶标DNA不存在时,银纳米簇的模板被固定在HP发夹的茎部,此双链结构不能介导银纳米簇的合成。当靶标DNA存在时,靶标能与P/HB探针结合形成双链平齐末端,此时外切酶Ⅲ能特异识别该平齐末端并逐渐水解完整的双链部分,同时释放出靶标DNA和P链。释放的靶标DNA即可进行重复水解循环。释放的P链可以进入下一个循环打开HP发夹结构并形成双链平齐末端,外切酶Ⅲ又能特异识别平齐末端产生新的水解,生成银纳米簇模板DNA (T-DNA),同时释放出P继续进行该循环产生更多的T-DNA。最终大量的银纳米簇模板被释放,该模板能特异介导银纳米簇的合成,从而表现出很强的荧光信号。通过荧光信号的测量即可检测靶标DNA的含量。该方法操作简便、成本低廉、无需标记,具有良好的选择性和灵敏度,为核酸的检测方法提供一种思路。二、DNA稳定的超强荧光银纳米簇的合成及其用于肿瘤细胞的免标记检测研究DNA稳定的荧光银纳米簇对模板DNA序列和构型具有高度依赖性,不同的DNA模板制备出的银纳米簇荧光性质差别很大,比如荧光强度和光谱位置的变化。银纳米簇也存在一些缺点,如DNA模板需求浓度高,部分序列合成的银纳米簇荧光强度较低且稳定性差,因而限制了银纳米簇在检测方面的灵敏性以及在复杂生物样品中的应用。为进一步探讨DNA模板对银纳米簇合成的影响和扩宽DNA稳定的银纳米簇的应用领域,在本工作中我们首先筛选出了一条可以合成超强荧光银纳米簇的DNA模板序列,其荧光强度超过目前己报道的绝大部分以DNA为模板合成的银纳米簇,而且其光学性质稳定,抗光漂白性能力强。然后,在该模板的序列的基础上,延伸一段可特异性识别CCRF-CEM细胞的aptamer(sgc8c),构建了一种免标记的荧光探针用于肿瘤细胞的灵敏检测。通过对比连接aptamer序列前后模板合成的银纳米簇的光谱性质,发现aptamer的加入并没有影响模板序列对银纳米簇的合成,之后的细胞实验也证明银纳米簇模板序列的加入不会影响aptamer对靶细胞的识别效果。因此,该模板序列稳定的银纳米簇有望在不同领域作为免标记探针得到更广泛的应用,同时也有望成为一种新的荧光探针应用于其他肿瘤细胞的检测及成像。
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【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.43
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本文编号：2393888