【摘要】：研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,具有高发病率和高死亡率,且发病率呈逐年上升的趋势,严重地威胁着女性的健康。随着人们的生活方式的改变,2型糖尿病在全球范围内发病率也呈现上升的趋势。2型糖尿病患者与乳腺癌患者有着相似的生活方式及免疫分子因素等,如高体重指数,腹型肥胖,体力活动少,摄取高热量食物及高胰岛素血症和胰岛素抵抗等。越来越多的流行病学研究表明2型糖尿病与乳腺癌的预后密切相关,2型糖尿病可显著升高乳腺癌的发病率,同时是乳腺癌患者复发和转移的一个独立的预后危险因子,合并有2型糖尿病的乳腺癌患者分期晚,预后差。高糖环境下,高代谢的肿瘤细胞可通过提高糖的利用率来促进肿瘤的增殖、迁移和侵袭。而肿瘤细胞的低氧、低营养、低pH的微环境可激活肿瘤细胞内的内质网应激反应,利用未折叠蛋白反应促进自身的发生发展。我们推测在高血糖的环境下,肿瘤细胞可通过内质网应激来促进肿瘤细胞的旺盛增殖。而预实验结果表明,间断高糖而不是持续高糖更能促进人乳腺癌MCF-7细胞内的内质网应激。本文将探讨间断高糖对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭的影响,以及内质网应激反应/PTP1B/STAT3信号通路在其中的作用。方法1.初步探讨间断高糖状态下,内质网应激是否被激活,以及间断高糖对MCF-7细胞的增殖、调亡、迁移和侵袭能力的影响。分别采用糖浓度5.5mmol/L、11mmol/L、 22mmol/L与5.5mmol/L的培养液交替培养,12小时后换液1次,处理MCF-7细胞2天、4天、6天,采用Western-blott方法检测人乳腺癌MCF-7细胞中内质网应激的标志物CHOP和GRP78蛋白的表达来确定最佳作用的糖的浓度和时间。当采用最佳作用的浓度和时间即22mmol/L处理MCF-7细胞6天后,采用MTT法,TUNEL法,划痕试验和侵袭试验检测细胞增殖、调亡、迁移和侵袭能力的变化；加用内质网应激的抑制剂(4-PBA)对MCF-7细胞进行处理,采用MTT法,TUNEL法,划痕试验和侵袭试验检测细胞增殖、调亡、迁移和侵袭能力的变化。2.我们进一步探讨间断高糖状态下的内质网应激是否由PTP1B所介导。首先采用间断高糖作用于MCF-7细胞,同时给予内质网应激的抑制剂4-PBA对MCF-7细胞进行处理后,采用RT-PCR和Western-blott方法来检测CHOP、GRP78、PTP1B、 STAT3的基因和蛋白表达的变化,同时采用蛋白酶分析检测PTP1B酶活性。然后用间断高糖处理MCF-7细胞后,加用PTP1B抑制剂(CinnGEL2Me)处理,采用MTT法,TUNEL法,划痕试验和侵袭试验检测细胞增殖、调亡、迁移和侵袭能力的变化,同时运用Western blot检测MCF-7细胞中CHOP、GRP78、PTP1B、STAT3的表达的变化。同样,采用基因沉默的方法下调PTPlB的表达,采用MTT法,TUNEL法,划痕试验和侵袭试验检测细胞增殖、调亡、迁移和侵袭能力的变化,同时运用Western blot检测MCF-7细胞中CHOP、GRP78、PTP1B、STAT3的表达的变化。结果1.从蛋白水平,处理6天时高糖组(22mmol/L)MCF-7细胞中内质网应激的标志物GRP78、CHOP蛋白的表达显著增加,可见高糖诱导的内质网应激呈浓度依赖性和时间依赖性。采用22mmol/L处理MCF-7细胞6天后,采用MTT法,TUNEL法,划痕试验和侵袭试验可发现间断高糖可增加细胞的增殖能力,减少细胞凋亡,促进细胞的迁移和侵袭,而内质网应激的抑制剂4-PBA可抑制高糖诱导内质网应激所导致的细胞增殖,增加细胞凋亡,抑制细胞的迁移和侵袭。2.采用RT-PCR和Western blot法检测间断高糖作用6天后的MCF-7细胞中内质网应激的标志物GRP78、CHOP的基因和蛋白的表达均显著升高,同时PTP1B以及u-STAT3的基因和蛋白的表达也随之升高,但p-STAT3基因和蛋白的表达降低。而内质网应激的抑制剂4-PBA可抑制这一过程。间断高糖诱导MCF-7细胞中内质网应激可增加细胞的增殖能力,减少细胞凋亡,促进细胞的迁移和侵袭,而PTP1B的抑制剂CinnGEL 2Me可以抑制内质网应激所导致的细胞增殖,增加细胞凋亡,抑制细胞的迁移和侵袭。当使用PTP1B抑制剂(CinnGEL 2Me)时u-STAT3、 PTP1B的基因和蛋白的表达下降；使用基因沉默的方式下调PTP1B表达,u-STAT3、 PTP1B的蛋白的表达亦随之降低,而p-STAT3的蛋白表达上升,同时,使用基因沉默的方式下调PTP1B表达可以抑制内质网应激所导致的细胞增殖,增加细胞凋亡,抑制细胞的迁移和侵袭。结论1.间断高糖可诱导人乳腺癌MCF-7细胞产生内质网应激,且呈时间和浓度依赖性。2.间断高糖可通过内质网应激促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖、抑制细胞凋亡,促进细胞的迁移和侵袭的能力,内质网应激抑制剂可显著抑制间断高糖的作用。3.间断高糖增加PTP1B酶活性。4.PTP1B的抑制剂或RNA干扰下调人乳腺癌细胞MCF-7中PTPIB的表达后,都可显著抑制间断高糖所导致的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。5.PTP1B的抑制剂或RNA干扰下调人乳腺癌细胞MCF-7中PTP1B的表达后,均能显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞内PTP1B/STAT3相关重要因子的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：2408387
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