【摘要】：【研究背景及目的】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),是世界上最常见的恶性肿瘤之一,虽然HCC的诊断及治疗取得了很大进展,但总体疗效仍不容乐观。蛋白酪氨酸磷酸化修饰广泛存在于所有真核细胞中,作为一种基础性的重要机制参与调节细胞信号转导,调控细胞增殖、细胞周期、细胞分化和发展,维持代谢平衡。蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTPs)和蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)通过相互拮抗协调作用调控并维持体内蛋白酪氨酸磷酸化水平。酪氨酸磷酸化异常是某些人类疾病主要的发病原因,目前已有多种PTKs抑制剂运用于白血病等临床恶性肿瘤的治疗,因此PTPs被认为是下一代临床药物治疗新靶点。SHP-1(src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1),是由PTPN6基因编码的含有SH2结构域的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,可通过其去磷酸化作用影响细胞增殖、分化、活性和凋亡。既往研究报道SHP-1可抑制白血病、淋巴瘤等多种肿瘤的发生发展,但其在肝癌中的作用尚不明确。有研究发现SHP-1在肝癌组织中表达降低,而索拉非尼等药物也可通过增加SHP-1活性,诱导肝癌细胞凋亡和自噬,从而抑制肝癌发生发展。以上报道提示SHP-1为肝癌的抑制因子,但是还需进一步证实SHP-1对肝癌的抑制作用,其抑制肝癌的作用机制也有待进一步研究。基于以上的研究背景,本课题旨在通过对人肝癌标本、体内体外生物学效应以及肝细胞特异性SHP-1基因敲除小鼠三个层面的研究来分析SHP-1对肝癌发生发展的影响,并探索其作用机制。【实验方法】一、SHP-1在肝癌组织中的表达及其临床意义1、SHP-1在肝癌及癌旁标本中表达情况为明确SHP-1在临床样本中的表达情况,我们收集了136对临床肝癌及其对应癌旁组织标本,提取组织RNA,利用Real-Time PCR方法检测其中SHP-1 m RNA的水平。2、SHP-1表达与临床恶性表型关系根据上述肝癌标本的Real-Time PCR结果,选取其中临床资料完整的84例肝癌患者样本,根据其癌组织中SHP-1表达量的中位数将这些标本分为SHP-1低表达组和SHP-1高表达组,并统计分析SHP-1表达与年龄、性别、肝硬化病史、乙肝表面抗原(HBs Ag)、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤大小、TNM分期、血管侵犯、有无子灶、包膜完整程度等临床恶性表型之间的关系。3、SHP-1与肝癌患者临床预后关系利用免疫组化技术检测含有271例人体肝癌组织的组织芯片中SHP-1蛋白的表达水平。按肝癌组织中SHP-1表达量的中位数将271例肝癌病人分为SHP-1低表达组及SHP-1高表达组。根据肝癌患者临床生存期资料分析SHP-1表达与肝癌患者总体生存期的关系二、SHP-1对肝癌细胞生物学行为的作用1、SHP-1对肝癌细胞增殖的影响利用腺病毒Ad SHP-1和化学合成的小干扰RNA(si SHP-1)感染或转染Huh7以及PLC两株肝癌细胞株,继续培养约12 h后将细胞按照3000个/孔分至96孔板中,利用CCK8法检测上调或下调SHP-1表达对肝癌细胞增殖能力的影响(观察周期约5-7天)。2、SHP-1对肝癌细胞迁移能力的影响利用上述同样的方法处理细胞,约12 h后将细胞按照50000个/孔或者70000个/孔分至transwell迁移检测小室中,48 h后观察并计数小室外膜上发生迁移的细胞数,明确SHP-1对肝癌细胞迁移能力的影响。3、SHP-1对肝癌细胞侵袭能力的影响方法基本同迁移实验,不同点为transwell侵袭小室聚碳酸酯基底膜上附有基质胶,使用前需水化两小时。4、SHP-1对肝癌细胞皮下成瘤能力的影响将感染腺病毒Ad SHP-1或对照病毒Ad GFP的肝癌细胞(Huh7)按照2′106/只分别接种于NOD/SCID小鼠两侧腋窝皮下,每三天观察一次肿瘤生长情况,记录肿瘤形成时间,并测量肿瘤大小,种瘤后34天处死小鼠,剥出瘤块称重并液氮冻存或制成蜡块保留组织,Real-Time PCR或者免疫组化检测SHP-1表达水平。肿瘤大小记录公式:体积=0.5×长径×短径2。5、SHP-1对肝原位种植瘤模型的治疗作用将带有荧光素酶基因的肝肿瘤细胞株Huh7细胞以2×106接种于NOD/SCID小鼠腋下,共2只。约3周后待肿瘤长至大小约500 mm3后处死荷瘤鼠,分离肿瘤组织标本,剪切为体积约1 mm3左右瘤块。打开小鼠腹腔,将瘤块直接种植于小鼠肝左叶内,制备小鼠肝脏原位种植瘤模型。用Berthold technologies公司的小动物活体成像系统动态监测肿瘤生长情况。种植瘤块约1周后利用活体成像将荧光强度相当的小鼠随机分为2组,每组7只,通过尾静脉分别注射腺病毒Ad SHP-1及对照腺病毒Ad GFP,2×109 pfu/只,每周2次,共3周,最后一次注射病毒后一周再次成像并处死小鼠。取出小鼠肝脏组织,并剥除瘤块称重,检测瘤内SHP-1表达水平,综合评估上调SHP-1表达对小鼠肝癌原位种植瘤模型的治疗效果。三、SHP-1对小鼠肝癌发生与发展的影响及其治疗作用1、验证Ptpn6~(HKO)小鼠肝脏中SHP-1表达情况将Ptpn6f/f小鼠与Alb-Cre小鼠杂交获得可在肝细胞中特异性敲除SHP-1基因的Ptpn6~(HKO)小鼠。对所有入组的小鼠于出生后第15天以及处死时进行剪尾,并抽提鼠尾DNA,利用PCR检测小鼠基因型。同时利用Western Blot检测小鼠肝脏组织、分离的小鼠原代肝细胞、原代肝星状细胞以及原代肝库弗细胞中SHP-1蛋白表达是否与基因型相符,非肝细胞中SHP-1表达是否受影响。2、肝细胞特异性缺失SHP-1后对小鼠DEN诱导肝癌形成及转移的影响将小鼠按照基因型分为肝细胞特异性SHP-1敲除组和对照两组(Ptpn6~(HKO)和Ptpn6f/f),按照体重分别在小鼠出生后第15天腹腔注射DEN(25μg/mg),后每2月处死一批小鼠观察肝脏肿瘤发生率、大小、数量以及肺转移率等指标,于小鼠出生后第11月终止实验。3、SHP-1对小鼠肝癌的治疗作用该部分利用DEN诱导Ptpn6~(HKO)小鼠形成肝癌(剂量和方法同前),在出生后第10月将小鼠随机分为2组各7只,分别通过尾静脉注射Ad SHP-1和Ad GFP(2×109pfu/100μl,2次/周,共3周),最后一次尾静脉注射病毒后一周处死小鼠,记录小鼠体重、肝重、肝脏肿瘤大小、数量以及肺转移发生情况,判断SHP-1对小鼠肝癌的治疗作用。四、SHP-1抑制肝癌发生发展的分子机制1、通过si RNA或腺病毒调控肝癌细胞株(Huh7)中SHP-1的表达,利用Western Blot检测肝癌细胞中MAPK、JAK/STAT、NFκB、PI3K/AKT等肿瘤相关信号通路的变化。2、利用Western Blot检测小鼠原代肝细胞中异常的信号通路,进一步在体内完善SHP-1抑制肝癌的机制。五、统计学分析研究数据采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析。两独立样本方差齐性数据采用Student’s t检验;χ2检验分析两样本率的比较;生存分析采用Kaplan-Meier分析和logrank检验;方差非齐性的配对资料采用Wilcoxon符号秩检验,而不配对资料采用Mann-Whitney U检验。P0.05为差异具有统计学意义,P0.01为差异非常显著。【实验结果】一、SHP-1在肝癌组织中的表达及其临床意义1、SHP-1在肝癌及癌旁标本中表达情况在所检测的136对肝癌组织标本中,肝癌组织中SHP-1表达量显著低于癌旁组织,且91.17%的肝癌组织SHP-1表达低于其对应的癌旁组织,其中45.59%的肝癌组织SHP-1表达下调超过2倍。2、SHP-1表达与临床恶性表型关系根据上述肝癌标本的Real-Time PCR结果,选取其中临床资料完整的84例肝癌患者样本,根据其癌组织中SHP-1表达量的中位数将这些标本分为SHP-1低表达组和SHP-1高表达组。和高表达组相比,SHP-1低表达组肝癌患者年龄明显偏小、AFP表达显著升高、肿瘤更大、TNM分期更晚。以上结果说明SHP-1低表达的肝癌患者更早发生肝癌,且与肿瘤的恶性表型发生密切相关。3、SHP-1与肝癌患者临床预后关系按肝癌组织中SHP-1蛋白表达水平的中位数,将271例肝癌病人分为SHP-1低表达组及高表达组。根据肝癌患者临床生存期资料分析SHP-1表达与肝癌患者总体生存期的关系。结果显示SHP-1低表达组中肝癌患者总体生存期明显低于高表达组。二、SHP-1对肝癌细胞生物学行为的作用1、SHP-1抑制肝癌细胞增殖通过Ad SHP-1过表达SHP-1后,肝癌细胞株Huh7和PLC的增殖能力明显受到抑制,另一方面,si SHP-1下调Huh7及PLC两株细胞中SHP-1表达量后则促进其生长增殖能力。2、SHP-1抑制肝癌细胞迁移能力利用Ad SHP-1腺病毒上调SHP-1表达的肝癌细胞株(Huh7和PLC)迁移能力明显受到抑制,而si SHP-1转染后其迁移能力得到明显增强。3、SHP-1抑制肝癌细胞侵袭能力利用Ad SHP-1腺病毒上调SHP-1表达的肝癌细胞株(Huh7和PLC)侵袭能力明显受到抑制,而si SHP-1下调SHP-1表达后其侵袭能力得到明显增强。4、SHP-1抑制肝癌细胞皮下成瘤能力(1)将Ad GFP或者Ad SHP-1处理后的Huh7细胞注射于小鼠皮下,在注射种植后第19天,37.5%(3/8)的Ad GFP组小鼠可触及皮下肿瘤形成,第25天,Ad GFP组所有小鼠皆形成皮下肿瘤(8/8),但是Ad SHP-1组小鼠直至第28天后才出现可触及的皮下肿瘤(3/8),直至实验截止时间(34天)Ad SHP-1组也仅62.5%(5/8)小鼠形成皮下肿瘤。(2)在所监测的所有时间点,Ad SHP-1组Huh7细胞皮下成瘤体积皆明显小于Ad GFP组。(3)Ad SHP-1组小鼠皮下成瘤大小和瘤重明显低于Ad GFP组,且肿瘤组织免疫组化结果显示Ad SHP-1处理后SHP-1明显过表达,而生长指数蛋白Ki67表达和Ad GFP组相比却明显下降。5、SHP-1对肝原位种植瘤模型有治疗作用将带luc-Huh7细胞皮下成瘤组织种植于小鼠肝脏后,经尾静脉注射Ad GFP或者Ad SHP-1腺病毒观察SHP-1对原位种植瘤模型治疗作用。(1)Ad SHP-1组小鼠肝脏荧光信号值显著低于对照Ad GFP组,Ad GFP组中两只小鼠因瘤荷太大死亡。(2)剥离肝脏瘤体也发现过表达SHP-1后明显抑制了原位种植瘤的生长,瘤重显著低于Ad GFP组小鼠。(3)免疫组化及Real-Time PCR检测证实Ad SHP-1组小鼠肝脏瘤组织中SHP-1表达明显高于对照Ad GFP组。三、SHP-1对小鼠肝癌发生与发展的影响及其治疗作用1、验证Ptpn6~(HKO)小鼠肝脏中SHP-1表达情况鼠尾DNA抽提后PCR鉴定基因敲除鼠(Ptpn6~(HKO))与对照小鼠(Ptpn6f/f)基因型。同对照小鼠相比,Ptpn6~(HKO)组小鼠肝组织中总SHP-1表达量明显降低,且原代肝细胞中几乎不表达SHP-1,原代肝星状细胞以及库弗细胞中SHP-1的表达无明显改变。以上结果提示Ptpn6~(HKO)小鼠有且只有肝细胞不表达SHP-1。2、肝细胞特异性缺失SHP-1后促进小鼠DEN诱导肝癌形成及转移(1)腹腔注射DEN后2月及4月龄两组小鼠肝脏均未形成肿瘤;6月龄时Ptpn6~(HKO)组中有33%(1/3)的小鼠肝组织HE染色后镜下可见肿瘤形成而Ptpn6f/f小鼠无肿瘤形成;8月后虽然两组小鼠均无肉眼可见肿瘤,但镜下观察发现Ptpn6~(HKO)组有80%(4/5)形成肿瘤,Ptpn6f/f组仅有33%(1/3)形成肿瘤;10月后Ptpn6~(HKO)组67%(4/6)出现肉眼可见肿瘤,83%(5/6)镜下可见肿瘤,而Ptpn6f/f组仅20%(1/5)出现肉眼可见肿瘤,40%(2/5)镜下可见肿瘤形成;截止11月,所有Ptpn6~(HKO)基因敲除小鼠均形成肉眼可见肿瘤,然而Ptpn6f/f组仅37.5%(3/8)出现肉眼可见肿瘤,镜下也只有50%(4/8)有肿瘤形成。(2)DEN造模11月后,Ptpn6~(HKO)小鼠肝癌发生率、肿瘤数量以及肿瘤大小统计均显著高于Ptpn6f/f小鼠,Ptpn6~(HKO)小鼠肝癌肺转移发生率以及转移瘤数量也显著高于Ptpn6f/f小鼠,提示肝细胞特异性缺失SHP-1后促进了DEN造模后小鼠肝癌形成及转移。3、SHP-1对小鼠肝癌有治疗作用该部分利用DEN诱导Ptpn6~(HKO)小鼠形成肝癌后通过尾静脉注射Ad GFP或者Ad SHP-1,观察SHP-1对肝癌的治疗效果。(1)Ad GFP组小鼠肝脏100%(7/7)存在明显肿瘤,而Ad SHP-1处理组仅71%(5/7)有肿瘤,且肿瘤数量和肿瘤大小统计也明显低于Ad GFP对照组,说明SHP-1对小鼠肝癌有明显的抑制作用,且其中两只小鼠肝组织中未发现有肿瘤组织,提示肝癌可能已被治愈。(2)Ad GFP组小鼠100%(7/7)存在肺转移,而Ad SHP-1处理组仅57%(4/7)存在肺转移,且肺转移数量显著少于Ad GFP对照组,提示SHP-1对肝癌肺转移也有显著治疗效果。四、SHP-1抑制肝癌发生发展的分子机制(1)SHP-1能明显抑制肝癌细胞JAK/STAT3、NFκB以及PI3K/AKT信号通路活化,对ERK以及p-38磷酸化水平无明显影响。(2)SHP-1缺失后,小鼠原代肝细胞中JAK/STAT3、NFκB和PI3K/AKT通路也明显活化,ERK和p-38磷酸化水平亦无明显改变。【结论】1、SHP-1在肝癌组织中表达显著降低,与肝癌患者临床恶性表型以及临床预后密切相关。2、SHP-1可抑制肝肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力,并显著抑制小鼠肝癌细胞皮下成瘤能力。3、肝细胞特异性缺失SHP-1后促进小鼠DEN诱导肝癌形成及转移,提示SHP-1在肝癌发生发展中起重要作用。4、提高SHP-1表达显著抑制小鼠肝癌生长,有望成为肝癌治疗的新靶点。5、SHP-1可通过负向调节JAK/STAT3、NFκB以及PI3K/AKT信号通路抑制肝癌发生发展。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
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