SRPK1在TGF-β介导的食管鳞状细胞癌细胞的增殖和凋亡中的作用

发布时间：2019-02-12 12:03

【摘要】：前言食管癌(Esophageal cancer)是最常见的消化道肿瘤之一,其典型症状表现为进行性咽下困难,根据病理组织学分型,食管癌可分为鳞癌、腺癌和腺鳞癌。在所有的恶性肿瘤中,食管癌的致死率居于第六位,尽管随着肿瘤治疗手段的进步,食管癌的5年生存率较30年前有了显著提高(约4%),达到10%-20%,但其生存率仍处于较低水平。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinomas, ESCC)是最常见的消化道侵袭性恶性肿瘤之一,预后较差,研究发现鳞癌与腺癌的生存率之间无明显差异。目前,治疗ESCC的常规有效的方法主要包括手术治疗、放疗及化疗,其中手术治疗最为常用。至今为止,尽管多种治疗方法已经应用于ESCC的治疗,但其五年生存率仍不能令人满意。因此,发现一种可预测ESCC预后的生物标志物在ESCC的治疗方面将具有重大的意义,并可用于在高危人群中筛查ESCC患者。所以,对ESCC分子机制的研究将有助于对ESCC患者的治疗。转化生长因子-β (Transforming growth factor-β, TGF-p)是一种多功能生长因子,主要由肿瘤微环境中的巨噬细胞、间质细胞和肿瘤细胞产生,可作为一种重要的炎症因子,在维持上皮细胞的稳定过程中起着重要的作用,同时对于许多重要的细胞过程也起着重要的调节作用,包括细胞周期的调节、细胞分化和细胞外基质的合成等过程。TGF-β的一个最主要的作用是抑制细胞增殖,因此TGF-β功能异常与多种肿瘤的发生有着密切的联系,例如结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、。肾癌、淋巴瘤、上皮细胞癌等。在正常的上皮细胞中,TGF-β可诱导G1周期的可逆性停滞,而在上皮细胞癌细胞中,TGF-β的功能明显被抑制。研究发现,TGF-β在食管鳞癌的浸润和转移过程中可能发挥重要作用,促进肿瘤的发生发展。丝氨酸／精氨酸蛋白激酶(serine-arginine protein kinase, SRPK)是一类能特异性磷酸化RNA剪接子内精氨酸-丝氨酸结构域的蛋白激酶,可与精氨酸-丝氨酸或丝氨酸-精氨酸二肽模体特异性结合,在细胞的生长发育过程中起着关键作用。在人体内,SRPK主要分为两种亚型,即SRPK1及SRPK2,这两种亚型主要分布在不同的组织器官之中,调节丝氨酸-精氨酸蛋白与mRNA前体的特异性结合,保证细胞的正常功能,同时在细胞周期的调控过程中也发挥着重要的作用。SRPK1是真核生物中一种高度保守的蛋白质,由一个PKC超家族激酶域和一个将该激酶域平均分为两部分的间隔区组成。一些研究表明SRPK1在富含丝氨酸／精氨酸序列的蛋白质(又称为RS-域蛋白)的特定氨基酸序列的磷酸化过程中起着重要的作用。RS-域蛋白主要作用于前体mRNA的翻译、加工、剪切,染色体的重建,细胞周期的调节及细胞结构的重构等过程。SRPK1的间隔区可参与SRPK1由细胞质到细胞核的转运过程。研究表明,SRPK1表达水平的提高与乳腺癌、肺癌及肝癌的发生风险和预后有关。有研究发现,SRPK1对神经胶质瘤细胞的生长及侵袭、迁移也具有重要的作用。但是SRPK1在肿瘤发展过程中的具体作用机制仍有待研究。根据目前的研究结果,本组认为沉默SRPK1基因的表达在肿瘤的发展过程中可发挥抗肿瘤的作用。然而,到目前为止,TGF-β-SRPK1在ESCC中的确切作用仍不清楚。为探究SRPK1在TGF-β介导的食管鳞状细胞癌细胞生物学过程中的作用和意义,我们应用免疫组化法、免疫印迹法及RT-PCR法检测120例食管鳞状细胞癌样本及细胞系中SRPK1的表达水平。并在体外实验中,检测加入TGF-β作用后的食管鳞状细胞癌细胞中的SRPK1的表达水平,从而分析并总结SRPK1在ESCC组织和细胞中的表达谱及其生物学作用,着重于探究发展有效的抗-SRPK1治疗方法的临床价值和优势。第一部分S RPK1在食管鳞癌中的表达及临床意义目的本研究通过应用免疫组织化学以及基因和蛋白检测方法观察SRPK1在食管癌组织及正常食管组织中的表达,并分析其在食管癌发生和发展及肿瘤转移、病理分级、临床分期中的关系,探讨SRPK1可能作为致癌基因在食管癌的诊断和治疗的临床价值,为其治疗提供新的靶点。材料与方法本实验选取山东省肿瘤医院及山东省医学科学院附属医院胸外科自2008年10月至2010年6月收治的120例食管癌病人,病人均经过手术治疗,切除的食管癌标本经两名病理科医师独立诊断证实。标本中癌组织作为实验组,相应标本的上切缘组织即距肿瘤5cm以上的正常食管组织作为实验对照组进行配对分组研究。应用免疫组织化学法检测SRPK1蛋白在食管癌组织及与其配对正常组织中表达的差异,探讨其在肿瘤演生、进展过程中的作用。采用SPSS19.0统计软件对实验数据进行统计学分析,SRPK1与食管癌临床病理因素之间的分析采用行卡方检验。以a=0.05作为统计学检验水准。结果：1.SRP K1在ESCC组织中的表达免疫组化染色表明,在120例ESCC组织中,有65例显示了高SRPK1表达,而在这65例ESCC组织中,SRPK1蛋白主要在细胞质和细胞核中表达,其中包括29例(++)和31例(+++)。然而,在癌周正常组织中则很少出现SRPK1染色。此外,SRPK1 mRNA的表达水平在肿瘤组织中明显增高。与无癌转移的食管组织相比,在有癌转移的ESCC样本中SRPK1 mRNA及蛋白的表达水平均显著升高。2. SRPK1与肿瘤临床病理特点之间的关系SRPK1的表达与肿瘤临床分期及肿瘤大小无明显相关性。相反,SRPK1的表达量与ESCC的转移之间具有显著相关性,其差异具有的统计学意义(p0.001)。3.SRPK1表达水平与ESCC病人预后的关系Kaplan-Meier生存曲线显示SRPK1表达水平与总生存率偏低密切相关(p0.000)。另外,单因素分析结果证实,SRPK1高表达的病人发生死亡的风险显著升高(p0.001)。同时,单因素分析结果还显示,ESCC转移性与不良预后有关,然而,患者的年龄、性别和肿瘤侵袭深度与预后之间无关联。多因素分析结果也显示,SRPK1表达可作为预测ESCC病人预后的独立预测因子(p0.001)结论：SRPK1蛋白在食管癌组织中的阳性表达率高于正常食管组织。SRPK1蛋白的阳性表达与临床分期及肿瘤大小无明显相关性,与ESC C的转移之间具有显著相关性。SRPK1表达水平与总生存率偏低密切相关,且高表达的ESCC患者的死亡风险明显增高,因此,SRPK1的表达可作为预测ESCC患者预后的独立预测因子。第二部分SRPK1在TGF-β介导的食管鳞癌细胞的增殖和凋亡中的作用目的：1.研究SRPK1在TGF-β介导的食管鳞状细胞癌组织及细胞系的表达水平。2.研究SRPK1在TGF-β介导的食管鳞状细胞癌细胞的增殖和凋亡过程中的作用和意义。3.探究SRP K1在TGF-β介导的食管鳞状细胞癌组织及细胞中的生物学作用。材料方法：1. SRPK1-WT 及 SRPK1-KD质粒和腺病毒载体的构建建立人ESCC细胞系EC109、TE8和TE2细胞,以进行相关的SRPK1的细胞水平检测。野生型SRPK1 (SRPK1-WT)的全长cDNA通过RT-PCR扩增正常食管上皮细胞mRNA获得,而SRPK1 (SRPK1-KD)无活性激酶突变体则通过将第109位的赖氨酸催化突变为丙氨酸获得。随后,将SRPK1-WT或者SRPK1-KD的cDNA插入pcDNA3.1 (-)A-myc/his表达载体。通过AdEasyTM XL腺病毒载体系统构建腺病毒表达SRPK-WT 或 SRPK1-KD。2.抗SRPK1质粒及siRNA转染质粒和siRNA均以脂质体2000为载体转入细胞内,Western blot法检测转染效率。应用Western b lot及RT-PCR方法分别检测EC109、TE8和TE2细胞系中SRPK1的表达,同时还应用、Vestern blot法检测细胞中AKT和JNK的磷酸化水平,从而评估SRPK1对TGF-β信号通路的潜在作用。3.细胞增殖实验检测检测SRPK1野生型及激酶失活型细胞的生存率,以探究SRPK1对细胞增殖的影响。4.采用TUNEL实验和免疫印迹方法探究SRPK1对ESCC细胞凋亡的影响。并设计损伤愈合实验和侵袭实验以探究SRPK1在EC109细胞的转移和侵袭过程的作用。5.应用流式细胞术和、Western blot法选择EC109细胞系来研究SRPK1对细胞周期的调控作用及对调控因子的表达的影响。结果：1.SRPK1在ESCC细胞中的表达在不同的细胞系中SRPK1的表达水平有所不同。SRPK1在TE2细胞系中表达水平最高,在EC109细胞系中表达水平最低。在EC109、TE8和TE2细胞系中,SRPK1主要在细胞膜或者细胞质中表达。2. SRPK1影响细胞增殖野生型S RP Kl可增强三种ESCC细胞系细胞的增殖作用,而激酶失活型则可抑制细胞增殖。同时,SRPK1基因沉默可显著抑制肿瘤细胞增殖。3. SRPK1影响细胞凋亡SRPK1基因敲除的阳性细胞中,活化-caspase3和cyclinD1的表达水平升高,而在对照siRM A组则无增高(p0.01)。同时,经si-SRP K1治疗后,EC 109细胞可出现凋亡相关的形态变化,如细胞萎缩变圆、细胞膜空泡化、细胞核断裂凝结等。在TE8和TE2等其他ESCC细胞系中,si-SRPK1作用后的细胞也会出现相同的变化。4. SRPK1调节AKT和JNK信号与对照siRNA组相比,在si-SRPK1处理组,磷酸化-AKT在三种ESCC细胞系中的表达水平均显著降低(p0.01),而磷酸化-JNK的表达水平则明显增高(p0.01)。5. SRPK1调控ESCC细胞的细胞周期、转移和侵袭过程EC109细胞周期G1期向S期转化的过程受到SRPK1 siRNA的抑制。同时,与对照组相比,ESCC细胞中的cyclin D1和CDK2的表达水平也受到明显抑制。损伤愈合实验显示,SRPK1 siRNA转染后的EC 109细胞的迁移性下降明显。同样,在侵袭实验中,与未转染组相比,SRPK1 siRNA转染后的EC109细胞的侵袭性也受到明显的抑制(p0.001)。结论：SRPK1在不同分化水平的ESCC细胞系中的表达水平有所不同,提示SRPK1在ESCC的发展中有一定的作用,且对细胞信号的起始和转导过程有一定的影响。SRPK1可通过调节TGF-β信号通路的活性来调节细胞增殖和凋亡之间的平衡,为TGF-β信号通路的一个重要组成部分。SRPK1亦可调控ESCC细胞的细胞周期、转移和侵袭过程,作为G1期向S期转化的关键调节因子。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

【参考文献】