蒿甲醚上调hsa-miR-134-5p抑制HSP90α蛋白表达促进热诱导口腔舌鳞癌Cal-27细胞凋亡的研究

发布时间：2019-02-23 14:38

【摘要】：[目的]探索蒿甲醚促进热诱导口腔舌鳞癌Cal-27细胞凋亡的相关机制,为蒿甲醚联合热疗治疗口腔舌鳞癌提供理论依据。[方法](1)用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,置37℃、5% CO2的培养箱中培养Cal-27细胞。(2)实验分组：对照组(Cal-27细胞)、蒿甲醚组(0.1mg/ml蒿甲醚处理Cal-27细胞)、热诱导组(43℃80min处理Cal-27细胞)、药热联合组(0.1mg/mL蒿甲醚+43℃80min处理Cal-27细胞)。(3)倒置显微镜观察细胞形态。(4) Annexin V-FITC/PI标记流式细胞仪检测细胞凋亡率。(5)CCK8法检测细胞增殖抑制率。(6) miRNA基因芯片筛选差异表达的miRNA, RT-PCR进行验证。(7)蛋白免疫印迹法检测HSP90 a蛋白表达量。(8) RT-PCR检测HSP90AA1 mRNA表达量。(9)双荧光素酶法检测hsa-miR-134-5p(miR-134)与预测靶基因HSP90AA1司的调控关系。(10)SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析。[结果](1)倒置显微镜观察细胞形态发现：对照组Cal-27细胞贴壁生长良好,呈多边形、椭圆形、大小不一,均匀分布。蒿甲醚组和热诱导组,细胞生长受到不同程度的抑制,细胞贴壁不均匀,部分细胞脱落。药热联合处理后,细胞生长明显受到抑制,大量细胞皱缩、变圆,形态不规则,部分细胞碎裂漂浮于培养基中。(2)CCK8检测细胞增殖抑制率发现：蒿甲醚组Cal-27细胞增殖抑制率为(27.19±6.64)%,热诱导组Cal-27细胞增殖抑制率为(32.70±6.78)%,药热联合组Cal-27细胞增殖抑制率为(42.04±6.31)%。蒿甲醚组与热诱导组之间比较,无明显统计学差异(P0.05)。药热联合组与蒿甲醚组或热诱导组比较,差异有统计学意义(P0.05)。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示：对照组Cal-27细胞凋亡率为(2.65±0.60)%；蒿甲醚处理组24h后Cal-27细胞凋亡率为(13.86±1.47)%,与对照组相比,统计学上有显著差异(P0.05)；热诱导处理组24h后Cal-27细胞凋亡率为(18.64±0.94)%,与对照组相比,统计学上有显著差异(P0.05)；药热联合处理组24h后细胞凋亡率为(29.24±1.01)%,明显高于蒿甲醚组或热诱导组(P0.05)。(4)芯片技术分析88个凋亡相关miRNAs表达变化,结果发现：与对照组相比,蒿甲醚组和药热联合组Cal-27细胞miR-134上调最为明显。蒿甲醚组Cal-27细胞miR-134表达量为正常组的10.68倍；药热联合组Cal-27细胞miR-134表达量为正常组的6.68倍。与对照组相比,蒿甲醚组和药热联合组Cal-27细胞中hsa-miR-144-3p (miR-144). hsa-miR-153-5p(miR-153)和hsa-miR-32-5p (miR-32)表达量下调明显。蒿甲醚组Cal-27细胞中miR-144表达量为正常组的43%,miR-153的表达量为正常组的45%,miR-32的表达量为正常组的43%。药热联合组Cal-27细胞中的miR-153表达量为正常组的22%,miR-32的表达量为正常组的40%。其余miRNA未见明显变化。RT-PCR验证其中miR-134的相对表达量发现：蒿甲醚组中的miR-134相对表达量为(2.17±0.18),与正常组对照,其相对表达量增加(P0.05)；在热诱导组中,miR-134相对表达量为(0.67±0.06),与正常组未见有明显差异(P0.05)：在药热联合组中,miR-134的相对表达量为(4.43±0.37),与正常组或者热诱导组比较,其相对表达量均增加明显(P0.05)。(5)免疫印迹检测发现,对照组Cal-27细胞HSP90 a蛋白相对表达量为(0.77±0.05)；蒿甲醚组为(0.48±0.06),较对照组表达明显降低(P0.05)；热诱导组为(0.98±0.12),较对照组明显升高(P0.05)；药热联合组为(0.63±0.09),较对照组及热诱导组明显降低(P0.05)。(6) RT-PCR检测HSP90AA1 mRNA相对表达量：蒿甲醚组Cal-27细胞HSP90AA1 mRNA相对表达量为(0.65±0.11),与正常组对照,其表达量降低(P0.05)；在热诱导组中,HSP90AA1 mRNA的相对表达量为(1.52±0.07),与正常组比较,其表达量增加明显(P0.005)。在药热联合组中,HSP90AA1 mRNA的相对表达量为(1.03±0.11),与热诱导组比较,其相对表达量明显降低(P0.05)。(7)双荧光素酶检测发现miR-134对含HSP90AA1-3'UTR的基因表达水平有显著抑制作用(P0.05)；miR-134对含HSP90AA1-3'UTR突变片段的荧光素酶报告基因表达水平无明显抑制作用(P0.05)。[结论]蒿甲醚能促进热诱导口腔舌鳞癌Cal-27细胞凋亡发生,上调miR-134抑制HSP90a蛋白表达可能是其作用机制之一。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.8

【参考文献】