【摘要】：目的通过检测分析DKK-3在胃腺癌中的表达量及其启动子区甲基化状况,探索研究其在影响胃癌发生、发展的进程中可能的作用机制。通过对人类胃腺癌细胞和人类正常胃粘膜的细胞系进行细胞培养,以获取充足的胃癌肿瘤细胞。明确胃癌细胞中DKK-3的表达水平,并应用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)检测技术,对胃癌细胞中DKK-3基因启动子区的甲基化状况进行检测分析。通过对DKK-3下游相关凋亡蛋白表达水平差异的检测分析,验证其肿瘤抑制机制,并在动物实验中进行验证,总结分析DKK-3在胃癌疾病进程中表达减低或沉默的原因,并探究其抑制胃癌进展的作用机理。方法收集并纳入158例胃腺癌蜡块病理样本及76例胃腺癌新鲜组织病理样本,分别通过免疫组化、PCR及Western Blot技术分析检测DKK-3在胃癌及癌旁组织中表达水平的差异。在几种常见胃癌细胞系及正常胃粘膜细胞系中应用RT-PCR及Western Blot技术检测DKK-3在细胞及组织样本中的表达情况。并在细胞实验中应用MSP检测DKK-3基因启动子区甲基化表达水平,并在病理组织样本中进一步验证其表达。选择人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞系培养,并通过甲基转移酶抑制剂5-AZA-dC处理癌细胞后,分组观察细胞生长变化,分别应用PCR及Western Blot检测DKK-3表达水平的差异,通过MSP检测两组胃癌细胞在应用5-Aza-dC处理前后的DKK-3表达水平的差异。选择BGC-823细胞采用质粒转染方法使DKK-3稳定高表达,分组观察细胞的生长变化,通过Western Blot验证转染效果后,采用细胞生长测试手段(MTT)及流式细胞分析(FCM,flow cytometry)技术分组检测转染前后细胞凋亡的变化情况。通过对人类BGC-823和SGC-7901胃癌细胞分组进行转染使DKK-3过表达后,应用Western Blot检测转染前后在c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)通路中磷酸化的JNK、Caspase-3及PARP表达水平的改变。对转染前后的BGC-823细胞应用广谱JNK抑制剂SP600125进行分组干预后,应用FCM检测分析细胞凋亡水平的改变。并应用Western Blot对转染前、后及SP600125处理后,磷酸化的JNK、Caspase-3及PARP表达量的差异分组进行验证。最后,将过表达DKK-3的人胃癌BGC-823细胞分组接种到裸鼠体内,观察种植瘤的生长情况,通过对种植瘤组织样本IHC检测,分析DKK-3在体内的表达率的差异,同时应用TUNEL技术检测裸鼠体内胃癌凋亡水平的变化情况。结果1.分别对158例人胃癌及癌旁的蜡块组织样本进行成组匹配IHC及76例人胃癌及癌旁新鲜组织样本进行PCR及Western Blot检测,发现胃癌组织中的DKK-3比其癌旁及正常组织中的阳性检出率更低,并发现随着胃癌组织分化程度由低到高,DKK-3的表达水平也逐步增高,提示DKK-3在胃癌组织中表达水平的减低是其发挥抑癌作用的表现。2.通过实时荧光定量核酸扩增检测qPCR、PCR及Western Blot检测发现,DKK-3在正常人胃粘膜细胞中的表达水平要高于人胃癌细胞。通过对76例人胃癌及癌旁新鲜组织样本分组进行MS-PCR检测发现,被检测到出现异常甲基化现象的胃癌组织样本要明显多于癌旁及正常胃组织样本。并发现随着胃癌组织分化程度由高到低,DKK-3的甲基化程度也逐渐增高,提示DKK-3基因启动子区的异常甲基化是引发DKK-3功能缺失并最终导致胃癌恶性进展的重要因素。接着通过MSP检测证实在胃癌细胞中也发生了基因启动子区甲基化现象,其甲基化程度比正常胃粘膜细胞高。使用甲基化酶抑制剂5-Aza-dC对胃癌细胞进行处理后,RT-PCR检测发现DKK-3的表达水平较前恢复提高,两组胃癌细胞均由之前的完全甲基化变为部分甲基化。进一步提示,在胃癌中DKK-3基因启动子的异常甲基化是其肿瘤抑制功能丧失的重要原因。3.选择人胃癌BGC-823细胞进行质粒转染过表达DKK-3后,再应用MTT及FCM对其检测发现,胃癌细胞的凋亡水平较对照组显著增高。通过Western Blot分组检测过表达DKK-3后的两种胃癌细胞中P-JNK、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的表达量后发现,上述蛋白的表达水平都较对照组增高。而在应用JNK抑制剂SP600125对经过转染的BGC-823进行干预处理,再通过FCM检测发现SP600125干预后的细胞凋亡相比过表达组有所减少,但仍较对照组高。继续在BGC-823细胞系中应用Western Blot对转染前、后及SP600125处理后P-JNK、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的含量分组检测,发现由SP600125处理组的表达量较转染组减少,提示凋亡较前减少,但较对照组仍偏高。4.把过表达DKK-3前后的人胃癌BGC-823细胞分组接种到裸鼠体内,观察种植瘤生长变化,发现过表达DKK-3组种植瘤成长速度明显比较慢,肿瘤大小亦明显较小。取种植瘤组织样本进行IHC检测发现,过表达组的DKK-3阳性率比对照组显著增高,应用TUNEL检测其结果提示,过表达DKK-3组的异体种植瘤中的肿瘤细胞凋亡水平较对照组显著增高。结论DKK-3基因的表达缺失及基因启动子区甲基化是胃癌中的常见事件,并且与肿瘤的恶性程度及预后密切相关;发生DKK-3表达缺失或减低的胃癌患者普遍都有一个显著缩短的存活期;DKK-3可以作为评估胃癌预后不良的独立预测标志物。DKK-3基因启动子异常甲基化的发生是其抑癌作用丧失的重要原因。DKK-3可以是通过激活JNK介导的细胞凋亡通路使胃癌细胞的凋亡增多,最终发挥其抑制胃癌进展的作用。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2
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本文编号：2440178
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