双氢青蒿素对头颈部鳞状细胞癌STAT3信号通路的影响及其机制研究

发布时间：2019-03-18 21:31

【摘要】：背景:头颈部鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是一种发生于口腔、鼻腔、鼻窦、咽部和喉部等黏膜组织的肿瘤,在人体恶性肿瘤中占第六位,拥有较高的致死率和致残率。尽管临床综合治疗方法提高了部分病人的疗效,但进展期(T3和T4)HNSCC患者的五年生存率未见显著提高。因此,亟待新的治疗理念和新型化疗药物尤其是分子靶向药物来治疗HNSCC患者并提高其的生存期。信号转导和转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STATs)家族是一类在肿瘤发生发展过程中起重要甚至关键作用的蛋白。STAT3是STATs家族中与肿瘤关系最为密切的成员,是一种信号转导蛋白,也是一种癌基因编码的细胞质蛋白,可以被许多肽类蛋白如细胞因子和生长因子激活。这些激活物直接或间接(通过激活细胞膜表面受体)磷酸化激活STAT3分子,磷酸化的STAT3单体通过SH2结构域互相作用,形成同源或异源二聚体。其结果是,二聚体STAT3进入细胞核内与特定的DNA相结合,调控与细胞增殖、周期、凋亡和血管生成等下游相关基因和蛋白的表达。在正常生理条件下,被激活的STAT3会在短时间内脱磷酸灭活变成单体回到细胞质中。而在人体主要的恶性肿瘤细胞中,STAT3的激活具有持续高表达的特点,持续激活的STAT3可促进肿瘤细胞无限制生长、抑制肿瘤细胞的凋亡、刺激肿瘤组织内部血管的生长等,这些变化都会加重肿瘤患者的病情。相反,靶向阻断STAT3激活则能够逆转STAT3的作用,进而抑制肿瘤的生长。因此,针对STAT3磷酸化激活,已开发出多种不同作用机制的抑制剂并进行了体外和体内研究。遗憾的是,由于不明确的副作用和药物本身特点等,没有一种抑制剂用于临床治疗肿瘤和临床实验研究。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是一种从中草药—青蒿素中提取的倍半萜内酯类物质衍生物,也是青蒿素治疗疟疾的主要活性成分。DHA抗疟作用优良,是用于治疗耐药疟疾、恶性疟疾和脑型疟疾的最有效药物之一。近年的大量研究显示,DHA能抑制多种恶性肿瘤细胞的生长,其机制主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期和抗血管生成而实现的。尽管一些研究对dha的抗肿瘤机制进行了探讨,但对hnscc细胞是否有抑制作用,以及其对凋亡和细胞周期上游信号通路的影响至今不清楚。目的:1.评估dha对hnscc细胞的增殖、周期、凋亡及迁移的影响;2.探讨dha成为一种stat3抑制剂的可能性;3.观察dha与顺铂联用对hnscc细胞的杀伤作用;4.建立hnscc移植瘤动物模型,评估dha对移植瘤生长的作用。方法:本课题分三部分进行研究。第一部分dha对hnscc增殖、周期和迁移影响的研究。首先,用mtt方法观察dha干预fadu、cal-27和hep-2细胞24和48h后细胞活力情况,计算出相应ic50后设定合理药物干预剂量。然后,不同浓度dha干预肿瘤细胞后,采用流式细胞仪观察细胞凋亡和周期的变化情况,同时用细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化。最后,用westernblot观察dha对hnscc细胞抗凋亡、细胞周期和血管生成等相关重要蛋白表达的影响。第二部分dha抑制hnscc生长的机制研究。首先,用westernblot观察不同浓度dha对三种头颈肿瘤细胞p-stat3、p-jak2、p-src、p-egfr、p-erk1/2和p-akt蛋白的影响。接着,用dha干预并用il-6(20ng/ml)刺激实验肿瘤细胞后,观察实验药物对p-jak2和p-stat3蛋白表达的影响。构建dn-jak2、dn-egfr、dn-src和ca-stat3质粒并瞬时转染鳞癌cal-27细胞,用dha干预24h,westernblot观察p-stat3、p-jak2、p-src和p-egfr蛋白变化情况,同时采用流式细胞技术检测dha对转染ca-stat3质粒细胞的细胞周期和凋亡的影响,进一步分析dha抑制hnscc增殖的机制。为进一步探讨dha对p-jak2和p-stat3的抑制作用,将其与stat3信号通路特异抑制剂azd1480及ag490一起处理实验hnscc细胞,对照比较分析dha成为一种新型stat3抑制剂的可能性。最后,将dha联合顺铂干预hnscc细胞,探讨其能否作为化疗药物用于治疗肿瘤。第三部分dha抑制hnscc移植瘤生长及其机制研究。利用头颈鳞癌cal-27细胞建立移植瘤balb/c裸鼠动物模型,给予实验动物50mg/kgdha或dmso进行干预,实验全程中观察动物体重和一般精神状态,定期测量移植瘤体积。28天后处死动物,切除瘤组织后称重并用westernblot观察stat3信号通路上下游蛋白表达情况,免疫组化方法观察p-stat3和p-jak2蛋白变化。验证dha的体外抗瘤结果的同时,为进一步用于hnscc患者的治疗提供了可靠的实验依据。结果:第一部分:dha抑制hnscc细胞增殖、周期和迁移。1.dha抑制三种hnscc细胞的增殖,且与剂量及干预时间呈依赖关系,其中,cal-27和hep-2两种细胞对dha较敏感,而fadu细胞的敏感性则稍差;dha对三种细胞的抑制作用主要由细胞凋亡增多和g0/g1期阻滞引起的;同时,dha也能抑制三种hnscc细胞的迁移能力。2.dha抑制fadu、hep-2和cal-27细胞mcl-1、bcl-xl、cyclind1、vegf、mmp-2和mmp-9蛋白的表达,且与药物剂量或时间呈依赖关系。第二部分:dha抑制hnscc细胞增殖与阻断jak2/stat3信号通路激活有关。1.在常氧和低氧条件下,dha干预fadu、hep-2和cal-27细胞后,p-stat3(tyr705)蛋白表达下降,但对p-stat3(ser727)无明显影响。2.不同剂量dha处理三种hnscc细胞后,p-jak2蛋白表达减少,而p-erk1/2、p-akt、p-src和p-egfr蛋白变化较小;并且,dha也能抑制il-6诱导的p-jak2和p-stat3。3.用dn-jak2、dn-egfr、dn-src、ca-stat3和空质粒转染cal-27肿瘤细胞并鉴定。转染质粒的四组细胞用dha干预后,p-jak2下调,而p-src和p-egfr无明显变化;转染ca-stat3质粒则可逆转dha引起的g0/g1期阻滞和细胞凋亡,并减轻p-stat3被抑制的程度。4.dha和stat3抑制剂azd1480及ag490一样,可下调hnscc细胞p-jak2和p-stat3表达,并与剂量呈依赖关系。5.hep-2和cal-27细胞用dha10μm联合顺铂10μm、dha20μm联合顺铂5或10μm处理后,fadu细胞用dha10或20μm联合顺铂5或10μm处理,chou-talalayci值小于1,效应点均落于直线内,细胞增殖显著受到抑制(p0.01)。第三部分:dha抑制hnscc移植瘤生长。干预组动物应用dha(50mg/kg,腹腔注射,5次/周)干预28天后,移植瘤体积显著小于对照组,而动物体重无明显变化;瘤体组织p-jak2、p-stat3、mcl-1、bcl-xl、cyclind1、vegf、mmp-2和mmp-9蛋白表达降低,而p-erk1/2、p-akt、p-src、和p-egfr则变化较小。结论:1.DHA抑制HNSCC细胞的增殖和迁移,增加凋亡细胞,促进G0/G1期阻滞的细胞数目,同时减少Mcl-1、Bcl-x L、Cyclin D1、VEGF、MMP-2和MMP-9的表达;2.DHA选择性抑制HNSCC细胞的STAT3分子Tyr705位点的磷酸化,这种抑制作用是通过特异下调p-Jak2蛋白实现的,提示DHA作用在STAT3激活前的过程;3.DHA抑制HNSCC细胞STAT3和Jak2的激活,对Akt和ERK磷酸化无明显影响,提示其有可能是一种新型的、具有一定特异的Jak2/STAT3信号通路抑制剂;4.DHA与顺铂联用具有协同抑制HNSCC细胞的效应,其机制是通过增加G0/G1期阻滞细胞数目实现的,提示DHA能够与其他化疗药物联合应用抑制肿瘤细胞增殖;5.体内实验证实,DHA能显著抑制HNSCC移植瘤体积,对实验动物体重等一般状态无影响,同时减少瘤体组织中Jak2/STAT3信号通路下游重要蛋白(抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-x L,促周期蛋白Cyclin D1,促血管生成蛋白VEGF,促迁移蛋白MMP-2和MMP-9)表达,提示其有可以成为一种用于临床治疗HNSCC患者的新型化疗药物。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.91

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