【摘要】：研究背景胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一,其发病隐匿、进展迅速、手术切除率低、放化疗效果不佳,预后极差,总体5年生存率不到5%,在全球癌症发病率中占第13位,排在所有恶性肿瘤致死原因的第四位。大多数的胰腺癌患者往往确诊时已出现淋巴或血运转移,从而失去了根治性手术治疗的机会。胰腺癌患者死亡的主要原因是肿瘤早期即发生局部侵袭或远处转移,也是制约患者预后的主要因素。目前胰腺癌的侵袭转移机制尚不明确,了解胰腺癌的恶性生物学行为发生机制,并给予适当的干预措施,对于提高胰腺癌的临床诊治水平并改善患者的预后具有十分重要的现实意义。同时筛选最佳的预后标志物,对于临床医师选择恰当的治疗方案,避免不必要的治疗带来的毒副作用,具有一定的临床指导意义。Bit1 (Bcl-2 inhibitor of transcription 1)是2004年发现的一个与细胞失巢凋亡相关的蛋白质,其正常定位于线粒体内膜,目前其确切生理功能尚未完全清楚。初期研究发现当细胞与细胞外基质失偶联即受到失黏附信号刺激时,Bitl蛋白从线粒体内膜转移至细胞胞浆中,拮抗胞质中的TLE1蛋白,并通过与胞浆中的转录共调解因子AES(amino-terminal enhancer of split)蛋白结合形成转录共调节复合物,启动一种特殊的凋亡形式,即非caspase(半胱氨酸蛋白酶)途径依赖的凋亡。目前研究认为肿瘤细胞的失巢凋亡抵抗与肿瘤的侵袭、转移及耐药密切相关,其中肿瘤细胞的EMT (Epithelial-MesenchymalTransition)过程在其中起着至关重要的作用。鉴于胰腺癌细胞的高侵袭性及转移能力强的特点,了解Bitl蛋白与胰腺癌细胞失巢凋亡的相关性及对侵袭转移能力的影响,并探讨其对胰腺癌细胞恶性生物学行为的作用机制,对于加深我们对胰腺癌分子机理的认识及寻找新的诊断或治疗靶点具有十分重要的意义。研究目的1.观察Bitl蛋白在六株胰腺癌细胞系中的表达情况及对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。2.探索Bitl蛋白对胰腺癌细胞生物学行为的影响机制。3.探讨Bitl蛋白在胰腺癌病人组织中的表达情况以及与胰腺癌病人临床病理特征的相关性及对预后的影响。方法：1. Western blot及Quantitative Real-time PCR技术检测六株胰腺癌细胞株中Bitl的基础表达情况。通过慢病毒载体将Bit1的干扰的质粒或过表达Bit1基因的质粒分别导入胰腺癌细胞株Panc-1和Mia paca2细胞中,通过抗性筛选,建立稳定沉默和稳定过表达Bit1的胰腺癌细胞株。2.CCK8法检测Bit1对胰腺癌细胞增殖及化疗敏感性的影响,利用流式细胞术检测细胞周期及凋亡,western blot检测Bit1蛋白影响胰腺癌细胞增殖活性及化疗敏感性的具体作用形式；利用Transwell和划痕实验检测Bit1与胰腺癌细胞运动、迁移、侵袭及转移的关系,western blot检测其可能的作用机制。3.应用western blot和免疫共沉淀技术检测Bit1蛋白影响胰腺癌细胞恶性表型的相关机制。4.利用胰腺癌组织微阵列平台结合免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)检测胰腺癌病人癌组织及癌旁组织中Bit1的表达情况,分析Bit1与胰腺癌病人临床病理特征及胰腺癌患者预后的关系。结果：1.在实验室已验证的六株胰腺癌细胞株中,Panc-1胰腺癌细胞株在mRNA及蛋白水平的Bit1表达是最高的,而Mia paca2细胞的表达是最低的。以Panc-1及Mia paca2为亲本株分别成功构建稳定沉默以及过表达Bit1蛋白的胰腺癌细胞株。2.敲低Bit1的表达并未明显影响胰腺癌Panc-1细胞株的增殖,但可抑制悬浮培养Panel细胞的凋亡,增加贴壁培养细胞的化疗敏感性并促进其凋亡。然而,在胰腺癌Mia paca2细胞过表达Bit1蛋白后,胰腺癌Mia paca2细胞的增殖亦无明显差异,但可增加悬浮培养胰腺癌细胞的凋亡比例,抑制贴壁培养的胰腺癌细胞的化疗敏感性并抑制其凋亡。Bit1敲减的胰腺癌Panel细胞的运动侵袭能力明显增强,而过表达Bit1蛋白后胰腺癌Mia paca2细胞的运动侵袭能力受到抑制。3. Western blot显示Bit1通过影响caspase3、PARP、cleaved caspase3以及cleaved PARP的表达影响胰腺癌细胞的凋亡,并通过改变一系列上皮间质转换(EMT)过程相关蛋白的表达影响肿瘤细胞的运动侵袭以及转移能力。Bit1可能通过调控Erk通路的活性影响胰腺癌细胞的运动侵袭能力。4. 对人胰腺癌组织微阵列切片进行免疫组织化学染色,结果发现Bit1蛋白在胰腺癌病人癌旁组织的表达水平显著高于癌组织(P0.05),且Bit1在胰腺癌组织中的表达水平与病人血清中的CEA水平以及神经浸润有相关性(P0.05)。单因素生存分析显示,饮酒、肿瘤分化程度、N分期、M分期和TNM分期与预后有相关性(p0.05),多因素Cox比例风险回归模型提示饮酒、N1期、TNM分期中的Ⅲ-Ⅳ期是患者不良预后的独立危险因素(P0.05)。结论：Bit1蛋白在胰腺癌细胞系中的表达存在明显差异,Bit1对胰腺癌细胞的增殖无明显影响,但敲低Bit1可促进肿瘤细胞的侵袭及转移,并影响其化疗敏感性。Bit1蛋白可通过调控胰腺癌细胞的EMT表型来影响肿瘤细胞的运动侵袭能力,其过程可能与Erk通路的激活存在关联性。Bit1蛋白在胰腺癌组织中低表达,并与胰腺癌的神经浸润密切相关,Bit1蛋白可能与其他临床指标结合共同影响胰腺癌患者的预后。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9
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本文编号：2445122
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