Rac1在上皮性卵巢癌上皮间质转化中的作用及机制的初步研究

发布时间：2019-03-23 18:11

【摘要】：卵巢恶性肿瘤占女性恶性肿瘤发病率的第六位,是女性癌症的第七大死因。上皮性卵巢癌(以下简称卵巢癌)(Epithelial Ovarian Cancer, EOC)是其中最常见的组织类型,是女性恶性肿瘤死亡的首要原因。在全世界,每年新发现卵巢癌204000例,因卵巢癌死亡125000例。卵巢癌是高度侵袭性的恶性肿瘤,有超过70%的患者发现时已处于Ⅲ期或Ⅳ期,其5年生存率分别为35%和20%。卵巢癌的扩散主要表现为腹腔内广泛播散和种植。尽管在EOC的研究方面已经取得了巨大的进步,但卵巢癌的发病机制尚属医学研究的盲区。因此,阐明卵巢癌的发病和侵袭转移机制,发现新的肿瘤标记物和分子治疗靶点,已成为目前攻克卵巢癌亟待解决的关键问题。上皮细胞性恶性肿瘤通常是通过淋巴道或血道播散,而EOC却有异于此传播方式。EOC传播的特点如下：(1)卵巢癌细胞的主要传播方式是直接蔓延,即在腹膜腔内扩散,淋巴转移发生较晚,血行传播少见；(2)卵巢癌细胞在形态学和分子学上发生了一系列改变,从而能够适应与腹膜内基质和间皮组织的接触,这些改变即为上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)。上皮间质转化,简称EMT,是指在各种内外因素的影响下,随着E-cadherin的表达下调,上皮细胞之间的粘附降低,同时,上皮样形态的细胞逐渐向间质样细胞状态转变,继而使细胞运动性增加、侵袭转移能力增强的过程。我们在前期研究中发现,WAVE1与上皮性卵巢癌(EOC)的不良预后密切相关,很有可能成为EOC的独立预后分子。我们课题组通过RNA干扰技术下调WAVE1的表达后,发现卵巢癌细胞SKOV3的侵袭转移及增殖均受到抑制。此外,我们还发现WAVE1的上游信号分子c-Abl也与EOC的不良预后有关。有大量文献显示,racl是WAVE1的另一个上游信号分子,它可以使WAVE1磷酸化而被激活,rac1/wave1信号通路在细胞运动中起着重要的作用。Rac1 (ras-related C3 botulinum toxin substrate 1),又称ras相关的C3肉毒素底物1,是Rho家族中Rac亚家族中的一员。Rac1基因全长29kb,位于人染色体7p22,包含7个外显子。Rac1基因转录产物有2种,分别为1.2kb和2.5kb。Rac1基因编码产物是一个鸟苷酸(GTP)结合蛋白,分子量约为20-25kD,通过与GTP核苷酸的水解和结合,该蛋白可在无活性的Rho GDP和有活性的Rho GTP之间转换,从而激活下游不同的信号通路产生不同的作用。近年来,有多篇文献显示,racl在胃癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中有异常增高。Rac1参与细胞运动、增殖和凋亡、侵袭转移等多种生物学过程,促进肿瘤的发生、发展。Racl在多种肿瘤的EMT过程中也起着重要的作用。然而racl与EOC发展与预后的关系及在EOC上皮间质转化中的作用尚未见明确报道。本研究在前期研究的基础上,探讨rac1在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)中的作用及其机制,以期阐明卵巢癌EMT机制,为干预卵巢癌侵袭转移提供新的理论依据。第一部分Racl在上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义目的检测racl在不同卵巢组织标本中的表达情况,探讨racl的表达与EOC临床病理特征的关系。方法(1)采用免疫组织化学方法分析24例正常卵巢组织,41例良性上皮性卵巢肿瘤组织,21例交界性上皮性卵巢肿瘤组织和150例EOC组织标本中rac1的蛋白表达情况,分析racl的表达与EOC各临床病理参数之间的关系。(2)采用Western blot方法检测正常卵巢组织标本18例,良性上皮性卵巢肿瘤组织标本28例,交界性上皮性卵巢肿瘤组织11例和EOC组织标本43例中rac1的蛋白表达情况,分析racl的表达与EOC各临床病理参数之间的关系。(3)应用Kaplan-Meier法分析racl的表达与EOC患者生存时间的关系；Cox回归分析研究影响EOC生存时间的因素。(4)采用qRT-PCR和Western blot方法检测人卵巢癌细胞株SKOV3、OVCAR-3、3A为、ES-2中rac1 mRNA和蛋白的表达,应用免疫荧光染色观察rac1在卵巢癌细胞株中的细胞定位。结果(1)免疫组织化学染色的结果显示：在150例EOC患者中,racl均呈阳性表达,其中83例(55.3%)呈高表达,67例(44.7%)呈低表达。76.2%(16例/21例)的交界性卵巢组织、87.8%(36例/41例)的良性卵巢组织、95.8%(23例/24例)的正常卵巢组织中,racl呈不表达或低表达。因此,rac1的表达水平在EOC中明显增高,与交界性卵巢组织、良性卵巢组织、正常卵巢组织相比,差异有统计学意义(P0.01)。Rac1的表达水平与血清CA125水平、临床分期、病理分级和术后残留肿瘤体积有明显相关性(P0.01),但与患者年龄、腹水量、肿瘤的组织学类型以及肿瘤的大小及部位无明显相关性(P0.05)。(2) Western blot检测的结果发现：rac1的表达水平在EOC组织中明显高于交界性卵巢组织、良性卵巢组织、正常卵巢组织(分别为1.810-0.390,0.543±-0.277,0.389±0.188和0.384±0.150),且差异有统计学意义(P0.05)。在43例新鲜EOC标本中,rac1的表达水平与血清CA125水平、临床分期、病理分级和术后残留肿瘤体积有明显相关性(P0.01),但与患者年龄、腹水量、肿瘤的组织学类型以及肿瘤的大小及部位的相关性不大(P0.05)。(3)Racl低表达组的5年生存率明显高于racl高表达组(P0.001),且无瘤生存时间明显延长(P0.001)。COX分析显示：与患者不良预后有关的因素为racl的高表达,肿瘤分期的中晚期和病理分级的低分化。(4)Racl在卵巢癌细胞株中的表达情况为：qRT-PCR结果显示,SKOV3、OVCAR3、3AO、ES2中rac1 mRNA的表达均较高,分别为：2.207±0.251,1.870±0.207,0.983±0.097,0.818±0.150。Western blot结果与qRT-PCR基本一致,SKOV3、OVCAR3、3A0、ES2中racl的表达为：1.256±0.156,1.370±0.060,0.724±0.0802,0.850±0.142。免疫荧光染色结果显示,rac1定位于卵巢癌细胞的细胞膜和细胞浆。结论(1)Rac1在EOC患者标本和卵巢癌细胞株中均为高表达。(2)Rac1的高表达与血清CA125水平、临床分期、病理分级和术后残留肿瘤体积呈正相关。(3)Racl与EOC不良预后有关,有可能成为EOC的独立预后分子,在EOC发生、发展中发挥重要的作用。第二部分Rac1基因shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染人卵巢癌细胞株的筛选目的构建rac1 shRNA'慢病毒载体,转染至卵巢癌细胞株SKOV3与OVCAR3中。筛选稳定转染的卵巢癌株并进行鉴定,为后续研究rac1在卵巢癌EMT中的作用奠定基础。方法(1)设计并合成两条含高效特异性靶向人racl基因的racl shRNA和一条阴性对照。通过双酶切实验和DNA序列测序对其重组质粒进行鉴定。(2)将测序鉴定正确的重组质粒进行慢病毒包装,转染到293T细胞,收获上清并浓缩测定滴度。(3)采用慢病毒载体转染法,将质粒转染至SKOV3和OVCAR3中,建立稳定转染的细胞株。(4)采用Real-time PCR和Western blot方法检测rac1在各组中mRNA和蛋白的表达,鉴定并获得rac1基因抑制效率最高的稳转细胞株。结果(1)设计合成2条rac1 shRNA (rac1 shRNA-1、rac1 shRNA-2)和一条阴性对照,双酶切法及DNA序列测定显示构建成功。(2)慢病毒载体介导的rac1 shRNA-1、rac1 shRNA-2和阴性对照成功转入SKOV3和OVCAR3,利用嘌呤霉素成功筛选获得稳定抑制rac1表达的SKOV3和OVCAR3细胞株。(3)采用Western blot和Real-time PCR检测和验证,得到rac1靶点干扰效果最佳的SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2细胞。结论(1)成功构建了racl shRNA'慢病毒载体及阴性对照。(2)成功筛选获得稳定转染racl shRNA慢病毒载体的卵巢癌细胞株及其阴性对照细胞株,并在mRNA和蛋白水平上对转染效果进行了鉴定。(3)成功筛选获得了racl基因抑制效果最明显的卵巢癌细胞株SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2,为后续研究racl在卵巢癌EMT中的作用奠定了基础。第三部分Racl对上皮性卵巢癌细胞细胞生物学特性的影响目的观察干扰racl基因表达后,卵巢癌细胞生物学特性的改变,证实racl在卵巢癌细胞中与EMT的关系,为卵巢癌转移提供一个新的研究方向。方法(1)采用划痕实验检测干扰racl基因表达后,SKOV3和OVCAR3细胞迁移能力的改变。(2)采用Transwell侵袭实验检测干扰racl基因表达后,SKOV3和OVCAR3细胞侵袭能力的改变。(3)采用粘附实验检测干扰racl基因表达后,SKOV3和OVCAR3细胞粘附能力的改变。(4)采用平板克隆实验检测干扰racl基因表达后,SKOV3和OVCAR3细胞克隆形成能力的改变。(5)采用BrDU渗入实验检测干扰racl基因表达后,SKOV3和OVCAR3细胞增殖能力的改变。(6)采用裸鼠成瘤实验检测干扰racl基因表达后,SKOV3和OVCAR3细胞体内肿瘤形成能力的改变。结果(1)干扰rac1表达对卵巢癌细胞迁移侵袭能力的影响划痕实验结果显示：干扰racl的表达后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2分别与SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,24h后细胞的迁移率明显降低(P0.05)。Transwell侵袭实验结果显示：干扰racl的表达后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2分别与SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,48h后到达小室膜下室面的细胞个数明显减少(P0.05)。粘附实验结果显示：干扰racl的表达后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2分别与SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,粘附能力明显减弱,且差异有统计学意义(P0.05)。(2)干扰racl表达对卵巢癌细胞增殖能力的影响平板实验结果显示：干扰racl的表达后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2分别与SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,克隆形成数目明显减少(P0.05)。BrDU渗入实验结果显示：干扰racl的表达后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-R12分别与SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,处于S期的细胞比例明显减少(P0.05)。裸鼠皮下成瘤实验结果显示：干扰racl的表达后,SKOV3-Ri1与SKOV3-NC相比,移植瘤生长速度减慢,肿瘤体积明显减小(P0.05)。结论(1)抑制rac1的表达,卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3的粘附、侵袭、转移、增殖能力受到抑制。(2)Racl可能与卵巢癌EMT过程有关,可能成为治疗卵巢癌,改善预后的潜在靶点。第四部分Rac1对上皮性卵巢癌细胞分子生物学特性的影响目的干扰racl的表达后,上皮细胞标记物(如E-cadherin)与间质细胞标记物(如Vimentin)是否发生了改变,为rac1在卵巢癌EMT中的作用寻找分子生物学证据；研究rac1表达下调后可能引起的卵巢癌细胞通路的变化,明确rac1引起卵巢癌细胞功能改变的分子机制。方法(1)HE染色观察干扰racl表达后,裸鼠移植瘤中卵巢癌细胞形态改变。(2)免疫组织化学染色观察干扰rac1表达后,裸鼠移植瘤中E-cadherin、vimentin蛋白表达的变化。(3) Western blot检测干扰rac1表达后,卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3中E-cadherin、vimentin蛋白表达的变化。(4) Western blot检测干扰racl表达后,卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3中pakl、p-pak1、p38 MAPK、p-p38MAPK蛋白表达的变化。结果(1)HE染色结果显示：SKOV3-NC组细胞排列紊乱,大小不一,极性消失,可见较多病理性核分裂像；SKOV3-Ri1组细胞排列较整齐,大小较一致,细胞中病理性核分裂像少见。(2)免疫组织化学染色结果显示：裸鼠移植瘤中,与SKOV3-NC组比较,SKOV3-Ri1组E-cadherin的表达上调,vimentin的表达下调(P0.05)。(3) Western blot结果显示：卵巢癌细胞中,分别与SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2细胞中E-cadherin的表达明显上调,vimentin的表达明显下调,且差异有统计学意义(P0.05)。(4) Western blot结果显示：卵巢癌细胞中,分别与SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2细胞中pak1、p-pak1、 p-p38MAPK的表达明显下调,且差异有统计学意义(P0.05),而p38MAPK的表达并无明显改变(P0.05)。结论(1)Rac1影响肿瘤EMT相关分子的表达,调节EOC的EMT过程。(2)Racl可能通过racl/pakl和p38 MAPK信号通路发挥生物学作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31

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