【摘要】：当今世界,尽管分子成像诸如FDG-_正电子发射断层扫描(FDG-PET)显著地提高了肺癌的诊断率,但肺癌仍是癌症相关性死亡的主要病因之一。根据肺癌的生物学特性和治疗方法,可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,非小细胞肺癌占多数,包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌等,治疗多采用手术为主的综合治疗。因此认识非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)的发生发展机制,对于提前预防和发病后的治疗具有重要的意义。HIWI是众所周知的人类PIWI家族的RNA沉默基因,在干细胞中能发挥自我更新的重要作用。大量的DNA修复因子存在于机体细胞中,同时因不同类型DNA损伤,而在机体中扮演着特异的修复角色,核苷酸切除修复系统是基因修复的一个重要途径,其中切除交叉修复基因1(Excision repair cross complementing geng1,ERCC1)在修复系统中起着一个连接损伤识别及切割的作用。当前,有关ERCC1与NSCLC之间关系的报道很少。因此主要研究HIWI和ERCC1基因在NSCLC组织中的表达情况,探讨HIWI对肺癌细胞的生长是否有促进作用；检测ERCC1的表达水平,分析HIWI及ERCC1表达与NSCLC患者临床特征的关系,探讨其在预后等方面的价值,为临床研究提供依据。第一部分HIWI表达水平调控对人类非小细胞肺癌细胞增殖的影响目的：通过评估HIWI在NSCLC标本中的过表达和HIWI对A549细胞生长的影响,揭示HIWI在NSCLC细胞生长中有重要作用,为研究新的抗癌疗法潜在靶标提供依据。方法：1.实验材料：随机选取经病理诊断为非小细胞肺癌癌组织57例为实验组,癌旁试样从肿瘤边缘距离之10毫米选取作为对照组(全部是在患者进行化疗和放疗前术中切除),立即在-80-C液氮中冷冻并储存,前瞻性记录所有标本的临床资料；同时在体外构建非小细胞肺癌A549细胞系。 2.RNA的提取和实时半定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测肿瘤内、癌旁标本和A549细胞中HIWI在mRNA水平上的表达。3.免疫印迹分析法(Western blot analysis)分析肿瘤样本中HIWI蛋白水平表达,用细胞裂解试剂将非小细胞肺癌的标本均质并使其受蛋白质的分离,所有的蛋白质样品通过10%的SDS-PAGE凝胶分离并转移至缓冲盐水中进行定量分析。4.A549细胞中HIWI表达的调控：为了在A549细胞中过表达HIWI,扩增野生HIWI编码序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转录成一个mRNA序列,并翻译成两个独立的蛋白质,HIWI-2A-EGFP-的pcDNA3.1(+)或控制的CAT-2A-EGFP-的pcDNA3.1 (+)载体通过用脂质体2000转染到A549细胞,所述HIWI和EGFP阳性细胞克隆,A549 HIWI (+)或CAT和EGFP阳性细胞克隆并检测细胞敲除HIWI表达。5.细胞计数法、CCK-8法和集落形成分析细胞计数。结果：1.HIWI在非小细胞肺癌标本中过表达：①通过RT-qPCR对非小细胞肺癌组织中HIWI mRNA表达进行了研究,结果表明了癌组织显著高于癌旁组织(均数差值0.7642,95%CI=0.5695-0.9590；R2=0.5249；P0.01：见图1A)；②免疫印迹检测显示癌组织HIWI蛋白水平的表达明显高于癌旁组织(P0.01：见图1B)。2.HIWI过表达促进A549细胞增殖：①构建A549HIWI (+)细胞和A549对照细胞的生长曲线(见图2A),克隆并分拣出GFP(+)细胞(见图2B)同时HIWImRNA(见图2C)和蛋白(见图2D)高表达细胞；②CCK-8细胞计数分析表明,A549 HIWI(+)的细胞增殖从24至96小时比A549对照细胞更迅速(P0.001和p0.01；见图3A)；③然后我们在顺铂的存在下重复了该实验,与A549对照组相比,A549HIWI(+)组细胞的增值率显著增高(24 h：p0.05和48h：p0.01；见图3B)；④A549HIWI(+)细胞和A549对照细胞之间的生长差异再次被克隆形成实验证实了,在24或48小时后,A549 HIWI(+|)细胞比A549对照细胞形成更多菌落(P0.01；见图3C/3D)。因此,我们证实了HIWI过表达对非小细胞肺癌A549细胞的增殖在体外也有促进作用。3.siRNAs敲除HIWI从而阻止HIWI过表达对A549细胞增殖的促进作用,我们用RNA干扰法重新评价了HIWI过表达对A549细胞的增殖的促进作用：①我们用HIWI特异性siRNA破坏了HIWI在A549 HIWI (+)细胞中的表达,与siRNA-con转染的细胞相比,siRNA-HIWI或siRNA-HIWI2转染后mRNA和蛋白水平中HIWI表达都显著降低(P0.01；见图4A/B)；②siRNA敲除HIWI对肺癌细胞增殖的影响：CCK-8细胞计数分析表明,siRNA-HIWI1或siRNA-HIWI2转染的细胞增殖显著降低(分别在24小时转染后P0.05,分别在48小时转染后P0.01,见图4C)；③克隆形成实验还表明,与siRNA-con组相比,菌落在siRNA-HIWI1和siRNA-HIWI2两者中的形成显著减少(P0.01；见图4D/E)。因此,我们再次通过功能丧失的方法确认了HIWI过表达对非小细胞肺癌A549细胞的增殖有促进作用。结论：1. HIWI mRNA和蛋白在人类非小细胞肺癌的癌组织中表达均高于癌旁组织；2.通过功能增益和功能丧失确定了HIWI对体外非小细胞肺癌细胞的生长有促进作用：3. HIWI可能对非小细胞肺癌的发生发展有促进作用。第二部分非小细胞肺癌组织HIWI和ERCC1的表达及临床联系目的：检测HIWI及ERCC1在人类非小细胞肺癌中的表达水平,分析其表达与非小细胞肺癌患者临床特征的关系,并探讨其在预后等方面的价值,为临床研究提供珍贵依据。方法：1.病例选择：收集行完全性手术切除且经过病理确诊的非小细胞肺癌组织标本共42例,所选组织标本均经过切片审核及复核,需要依据资料的完整性及随访情况,确定资料的完整。选择国际抗癌联盟1997版修订的非小细胞肺癌分期标准为依据,参考术前影像学以及术后病理资料确定入选病例临床分期为Ⅰ-Ⅲa期,其中Ⅰ a-b期18例,Ⅱ a-b期11例,Ⅲa期1 3例。所选患者生存期为(7-76)个月,平均生存期为(35.6+1.5)个月。2. HIWI和ERCC1表达检测：对42例非小细胞肺癌患者手术切除标本予以S-P法进行HIWI和ERCC1表达的检测,染色定位主要是在细胞核,选定阳性细胞着色强度以及阳性细胞在同类细胞数中的百分比来进行半定量结果判定,0分用(-)表示,1-3分表示为弱阳性,可用(+)表示,3-8分为中度阳性(++)表示,9-12分为强阳性,用(+++)表示,依据实验切片、HE染色片以及阴性对照片来对结果进行判定,最后进行复核,(++)以上方定义为阳性表达。3.研究了HIWI和ERCC1表达与肺癌瘤体大于5cm、瘤体分叶、瘤体毛刺征、器官受累及肺门纵隔淋巴结肿大的关系。4.所得统计学数据根据临床分期、组织病理学类型、年龄结构、性别、预后等进行分组比较。5.HIWI和ERCC1进行相关性分析。结果：1.42例患者中,HIWI阳性表达率为55.6%.ERCC1为45.24%,且发现二个因子表达水平与患者年龄、性别、吸烟、及病理情况无显著相关性(P0.05),而与临床分期有关(P0.01)。 2.本组中共42例非小细胞肺癌患者,生存期为7-76个月,平均生存期为(35.6±1.5)个月。①ERCC1阳性表达者19例,平均生存期为(25.44±1.2)个月；ERCC1阴性表达者23例,其平均生存期为(45.1±2.3)个月,通过统计学处理显示,ERCC1阳性表达与阴性表达者的生存期有着明显的差异,阴性表达者优于阳性表达者(P=0.003)；② HIWI阳性表达者23例,平均生存期为26.2个月；ERCC1阴性表达者23例,其平均生存期为45.1个月,通过统计学处理显示,ERCC1阳性表达与阴性表达者的生存期有着明显的差异,阴性表达者优于阳性表达者(P=0.003)。3.HIWI与ERCC1的表达呈正相关,相关系数为0.841。4.非小细胞性肺癌瘤体大于5cm、瘤体分叶、瘤体毛刺征、器官受累及肺门纵隔淋巴结肿大中,除了肺门纵隔淋巴结肿大外HIWI和ERCC1阳性表达均远大于阴性表达,差异就有统计学意义。结论：1.HIWI和ERCC1在非小细胞肺癌中有一定表达,阳性表达率分别为45.24%和55.6%,表达水平与年龄、性别、吸烟情况以及病理类型无明显关联,而与临床分期有关；2.在非小细胞肺癌中,HIWI和ERCC1阴性表达者的平均生存期优于阳性表达者,可以作为预后判断指标；3.非小细胞肺癌中HIWI和ERCC1的表达呈正相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
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