成人混合表型急性白血病的临床和分子遗传学研究

发布时间：2019-03-25 08:20

【摘要】：目的1.系统总结单中心按WHO-2008诊断标准确诊的成人混合表型急性白血病(MPAL)患者,分析其临床、形态学、免疫学和细胞遗传学(MIC)特征。2.应用靶向外显子捕获+重测序技术及微阵列比较基因组杂交(array-CGH)技术对部分MPAL患者进行了基因突变的筛选及DNA拷贝数变异(CNVs)的检测,阐述MPAL的分子遗传学特征。3.阐述MEF2C基因在急性髓系白血病中的的临床意义及生物学效应。方法1.从1998年1月至2011年7月期间于苏州大学附属第一医院确诊的4780例确诊的急性白血病中,按照WHO-2008标准筛选MPAL,收集患者初诊时白细胞、血红蛋白、血小板以及形态学、免疫学、细胞遗传学等资料;对于部分在我中心治疗的MPAL患者,分析其临床治疗方案及预后。2.收集MPAL患者初诊时骨髓单个核细胞,采用多重巢式RT-PCR方法对42例MPAL患者进行白血病常见的29种融合基因的检测;采用基因组DNA-PCR方法对31例MPAL患者扩增C-KIT、NPM1、FLT3-TKD、FLT3-ITD、EZH2、RUNX1、ASXL1、IDH1、IDH2、CBL、WT1、TET2、DNMT3、PHF6、FBXW7、NOTCH1和ETV6共16种基因,PCR产物用直接测序法分析是否存在基因突变,另外IKZF1基因是否存在变异采用RT-PCR和毛细管电泳方法检测;利用人外显子捕获芯片对28例MPAL患者进行了与肿瘤发生相关的500种基因变异的分析;利用人安捷伦244k的CGH芯片对12例MPAL患者进行了基因拷贝数的检测,阐述MPAL患者的分子遗传学特征。3.采用实时荧光定量PCR技术检测我中心83例初诊成人AML患者的骨髓液单个核细胞、12例正常对照骨髓液单个核细胞中MEF2C基因m RNA表达水平。比较MEF2C基因m RNA表达水平在AML患者和正常对照之间以及AML各亚组之间的差异。分析MEF2C基因m RNA表达水平与AML患者无事件生存(EFS)、总体生存(OS)的关系。同时制备MEF2C过表达载体及靶向抑制MEF2C的sh RNA慢病毒载体,分别侵染髓系白血病细胞株Dami,采用绝对计数等方法检测其对细胞增殖能力的影响。结果1.117例MPAL患者临床及MIC特征分析从1998年1月至2011年7月期间在我中心确诊的4780例急性白血病患者中,根据2008年WHO标准共筛选出117例(2.4%)患者可以被确诊为MPAL(60例男性和57例女性),中位年龄为35岁(14-81岁)。MPAL患者初诊时在骨髓原始细胞比例、血红蛋白和血小板计数方面与其它类型急性白血病无明显差异,但高白细胞计数和肝脾肿大相对多见。依照FAB分型标准,40例(34%)的患者表现为AML,M1和M5多见。51例(44%)的患者被归为ALL-L1,其余26例(22%)患者依据形态学无法分类,被归为不能分类的急性白血病。117例患者中有64例(55%)为B淋系和髓系混合表达,38例(33%)为T淋系和髓系的混合表达,14例(12%)为B淋系和T淋系混合表达,另一例(0.9%)为T、B和髓三系混合表达。B和T淋系混合表达的MPAL多见于男性,14例T和B淋系混合表达的病例中有11例(79%)为男性,与其他两组相比有统计学差异(P=0.01)。82%的病例显示了白血病细胞表面存在CD34的高表达。在92例能成功进行核型分析的MPAL病例中,33例(36%)患者未发现核型异常,而59例(64%)患者显示了核型异常。其中复杂核型异常(≥3种异常)最为常见(22/92例;24%)。14例(15%)患者存在t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1融合基因阳性,且均为B+My混合表型。7例患者(7/92;7.6%)存在单体7;7例患者(7/92;7.6%)有21多体。5例患者(5/92;5.4%)患者存在+8异常,且均为B+My混合表型。4例患者(4/92;4.3%)存在t(v;11q23)/MLL重排异常,其中两例为t(11;19)(q23;p13)、1例为t(4;11)(q21;q23)、1例为t(9;11)(p22;q23)。3(3/92;3.3%)为t(10;11)(p15;q21),其中两例为T+My混合表达,1例为B+T淋系混合表达。在另外3例患者中发现了三种迄今为止尚未报道过的染色体易位,1例B+My患者为t(7;9)(q32;p24),1例B+T患者为t(2;9)(q13;q34),另1例T+My患者为der(9)t(9;11)(p21;q12)。在1例核型分析为t(3;11)(q29q13;p15)del(3)(q29)的患者中发现了最近报道过一种新的融合基因,即NUP98和IQCG基因的融合。34例初治MPAL的患者在我中心接受了治疗。24例患者接受了兼顾淋系和髓系的联合方案,14例(58%)取得了完全缓解(CR),另外10例接受CAG方案诱导治疗的患者中7例(70%)取得了缓解。在CR率上两组之间无统计学意义(P=0.802)。其中6例采用联合方案诱导失败的患者中采用CAG方案再诱导化疗,有5例(83%)患者再次获得了CR。而且8例接受异基因造血干细胞移植的患者总生存优于单纯化疗组的MPAL患者(中位生存时间分别为22个月和9个月;P=0.004)。2.MPAL患者的分子遗传学特征研究多重巢式RT-PCR结果:12例(28.6%)患者检测到存在BCR/ABL融合基因(其中7例患者在染色体核型检查时也发现了Ph染色体)。3例染色体核型正常的MPAL患者中,我们分别检测到SIL/TAL1融合基因(1p32微缺失所致),dup MLL基因重排和MLL/AF9融合基因各1例。另外我们还在1例伴有t(16;17)等复杂核型异常的MPAL患者中检测出SET/CAN融合基因。基因突变分布及发生率:31例MPAL患者采用PCR、Sanger、毛细管电泳等技术进行了17个基因的突变检测,其中12例患者(39%)检出≥1种基因突变,包括IKZF1缺失4例(4/31;13%)、EZH2突变3例(3/31;9.7%)、ASXL1突变2例(2/31;6.5%);ETV6、NOTCH1和TET2突变各1例(1/31;3.2%)。31例患者中,11例成功进行了核型分析,发现10例患者存在核型异常。8例伴t(9;22)(q34;q11)和B+My异常的MPAL患者有4例(50%)检测到IKZF1缺失。对其中24例患者的预后进行了分析,突变阳性和阴性组的患者之间未发现明显的生存差异(P=0.158)。外显子捕获测序分析:28例MPAL患者进行了人外显子捕获和测序,结果与人参考的基因组(Hg19)相比较,剔除SNPs。显示42.9%(12/28)具有表观遗传学调控基因的突变,最常见的突变为EZH2基因突变(4/28;14.3%),3例T淋系和髓系混合表达的MPAL中发现了DNMT3A基因突变(3/28;10.7%),GATA2和TET2基因突变各2例(7.1%),1例MPAL患者中发现存在IDH1基因突变。上述突变的患者部分还伴有其它基因异常,如NOTCH1和TP53基因。未发现其它表观遗传学相关调控基因存在突变,如KRAS、NRAS、CREBBP和NF1等。在此组病例中,还同时发现另外9例MPAL患者中存在IKZF1(4/28;14.3%)、ASXL1(2/28;7.1%)、RUNX1(2/28;7.1%)和ETV6(1/28;3.6%)四种重要转录因子的基因变异(共占32.1%)。本研究中共发现75%的成人MPAL患者在初诊时存在体细胞水平的基因变异。array-CGH分析结果:12例MPAL患者进行了array-CGH分析,发现每例患者至少有一种基因组异常,共发现68种基因组异常,平均每例样本有5.7种异常。在此组MPAL病例中,我们新发现了几种隐匿性的拷贝数异常,如CDKN2A(4/12)、IKZF1(3/12)、MEF2C(2/12),同时还发现BCOR、EBF1、KRAS、LEF1、MBNL1、PBX3和RUNX1异常各1例(8.3%)。3.MEF2C在成人AML患者中的表达、意义及其功能的初步探讨(1)AML患者MEF2C基因m RNA表达水平高于正常对照组(P值=0.0377)。按FAB分型分组:FAB-M5亚组AML患者MEF2C基因m RNA表达水平明显高于FAB-M1、M2、M4亚组(P值分别为0.029、0.003、0.021);FAB-M3亚型组AML患者MEF2C基因m RNA表达水平明显低于其它组(P值均0.001);而FAB-M1/M2、M1/M4、M2/M4组间AML患者的MEF2C基因m RNA表达水平无统计学意义(P值分别为0.2、0.055、0.279)。按染色体核型进行分组,其它核型AML患者组MEF2C基因m RNA表达水平高于CBF-AML和正常核型组(P值分别为0.036和0.033);伴有t(15;17)异常的AML患者组MEF2C基因m RNA表达水平明显低于其它核型组(P=0.003)。(2)采用Kaplan-Meier分析,正常核型AML患者中MEF2C基因m RNA低表达组和高表达组患者3年EFS分别为56%和20%,MEF2C基因m RNA低表达组的EFS优于高表达组(P=0.048);低表达组和高表达组患者的3年OS分别为40%和16%(P=0.07)。而MEF2C基因m RNA表达与CBF-AML及其它中危核型患者的预后没有关系,EFS和OS差异均无统计学意义(P值均0.05)。(3)使用两条独立的sh RNA序列能有效抑制髓系细胞株Dami细胞中的MEF2C表达,沉默MEF2C使髓系细胞株Dami细胞的生长及集落形成能力下降。但在Dami细胞株中过表达MEF2C未见到对其增殖能力造成明显影响。结论1.成人MPAL是一组异质性较大的疾病,在急性白血病中发生率为2.4%。MPAL以B淋系和髓系混合表达最为常见,64.1%的患者存在细胞遗传学异常,其中以复杂核型和Ph染色体异常相对常见。现有化疗方案预后差,异基因造血干细胞移植有可能改善其长期生存。2.多重巢式PCR技术可以提高MPAL患者基因重排的检出率。MPAL患者中存在高频率的基因变异率,75%的成人MPAL患者在初诊时可以被检出存在基因变异,包括表观遗传学相关基因(42.9%)和重要转录因子的相关基因(32.1%)。3.在2例MPAL患者中首次发现存在再现性的转录因子MEF2C的新激活方式-基因缺失。AML患者中MEF2C基因m RNA表达水平明显升高,对于正常核型AML患者而言,荧光实时定量检测MEF2C基因m RNA表达水平有提示预后的价值;沉默MEF2C基因表达能抑制AML细胞株Dami的增殖。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

【参考文献】