新基因CIAPIN1在胃癌转移及血管生成中的作用及机制研究

发布时间：2019-03-25 21:08

【摘要】：胃癌目前为止仍然是世界上公认的威胁人类健康的问题之一,尽管近年来胃癌在西方国家发病率已明显下降,但多数胃癌患者发现时已为中晚期并发生转移,失去手术机会,转移仍是其致死的主要原因,影响患者的生活质量及预后。胃癌侵袭转移的本性由一系列分子事件决定,包括多种癌基因及抑癌基因的突变,生长因子及其受体异常表达等,是多基因参与、多种信号转导蛋白的调控及多步骤协同的复杂网络过程,从而导致控制肿瘤生物学行为的下游信号转导分子的表达,增强胃癌细胞诱生血管生成的能力。其发生机制尚未阐明,需要进一步深入研究。细胞因子诱导的凋亡抑制因子1(Cytokine-induced apoptosis inhibitor1,CIAPIN1)在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用,CIAPIN1与多种肿瘤的耐药、增殖、预后密切相关。我们实验室前期研究发现CIAPIN1在胃癌组织中低表达,参与胃癌的增殖与多药耐药的调控,可能作为多个信号通路中的关键分子参与胃癌发生发展的多个过程。但CIAPIN1在胃癌转移及血管生成中的作用以及分子机制还未见报道,需要我们深入探讨。因此,研究CIAPIN1在胃癌转移及血管生成中的作用及分子机制,可为深入理解胃癌发生发展的分子事件提供理论依据。目的:1.观察CIAPIN1在临床组织标本中的表达水平与胃癌侵袭、转移及血管生成的相关性;2.体外实验观察CIAPIN1对胃癌侵袭、转移及血管生成的调控作用;3.初步探讨CIAPIN1介导胃癌血管生成的可能分子机制。方法:1.免疫组织化学方法检测CIAPIN1在正常胃黏膜组织、转移胃癌以及非转移胃癌组织组织中的表达变化,Chi-square test统计分析CIAPIN1与胃癌转移的相关性;2.免疫组织化学方法检测CIAPIN1、VEGF以及CD31-MVD在胃癌及癌旁组织中的表达,Chi-square test统计分析CIAPIN1和VEGF的表达与胃癌患者临床病理参数的相关性,Sperman分析CIAPIN1和VEGF的表达及CD31-MVD计数之间的相关性,分析CIAPIN1与胃癌血管生成的相关性;3.构建CIAPIN1正义真核表达载体及特异性si RNA表达载体,并分别将其以及相应对照空质粒载体转染胃癌SGC-7901细胞系,G418筛选获得稳定转染的细胞系,利用Western-blot及RT-PCR验证转染效率;4通过细胞Transwell实验从体外功能学证实CIAPIN1对胃癌细胞侵袭、迁移的作用,观察CIAPIN1对胃癌转移的调控作用;5采用肿瘤条件培养基法建立Co-HUVECs细胞,利用MTT细胞增殖实验、细胞化学粘附实验、细胞迁移实验观察CIAPIN1对HUVEC细胞的增殖、粘附、运动迁移的作用,利用体外小管形成实验(tube formation assay)观察CIAPIN1对胃癌细胞诱生血管生成能力的影响;6收集高/低表达CIAPIN1的胃癌SGC-7901细胞系的蛋白,Western-blot检测血管生成相关分子:VEGF,CDC42,HIF-1α,IL-6,IL-8,探讨CIAPIN1调控胃癌血管生成的可能分子机制。结果:1.免疫组化结果显示:CIAPIN1在胃癌组织中的表达水平显著低于其对应的癌旁组织(P=0.0008);发生转移的胃癌组织中CIAPIN1表达低于其在未发生转移的胃癌组织中的表达水平(P0.0001);此外,CIAPIN1的表达与胃癌的TNM分期密切相关(P=0.0037);2.VEGF在胃癌组织中的表达显著高于其在癌旁组织中的表达水平(P0.0001),在胃癌组织中表达的阳性率为68%,VEGF的表达与患者肿瘤分化程度密切相关(P=0.0042);此外,胃癌组织的CD31-MVD计数(55.82±3.344)显著高于癌旁组织的CD31-MVD计数(12.16±1.211)(P0.0001)。进一步Sperman等级相关性分析显示CIAPIN1的表达与VEGF的表达以及CD31-MVD计数成负相关;3 Western-blot以及RT-PCR实验结果均显示正义真核表达载体pc DNA3.1-CIAPIN1可以上调CIAPIN1在胃癌SGC-7901细胞系中的表达,相反特异性psi?CIAPIN1-2载体可以显著抑制胃癌SGC-7901细胞系中内源性CIAPIN1的表达;4.转染正义真核表达CIAPIN1载体后,胃癌SGC-7901侵袭、迁移细胞数显著少于对照组,而转染特异性si RNA的质粒载体后SGC-7901侵袭、迁移细胞数显著多于对照组(P0.05);5.建立Co-HUVECs细胞,CIAPIN1过表达时,HUVEC细胞增殖减慢、细胞粘附数及迁移数减少,体外小管形成实验显示HUVEC细胞形成小管的长度及数量均低于对照组;下调CIAPIN1表达得到类似的结果,差异均具有统计学意义(P0.05);6.Western-blot实验显示:抑制CIAPIN1在胃癌SGC-7901细胞内表达可上调CDC42、VEGF、HIF-1α、IL-8等血管生成相关分子的表达。结论:1.免疫组化结果显示新基因CIAPIN1在胃癌组织中表达水平显著低于正常胃黏膜组织,在转移的胃癌组织表达水平显著低于非转移胃癌组织及正常胃黏膜组织,CIAPIN1在胃癌组织中的表达水平与VEGF的表达水平及CD31-MVD计数成负相关,提示CIAPIN1与胃癌的转移与血管生成密切相关;2.体外细胞实验发现CIAPIN1可抑制胃癌SGC-7901细胞的侵袭、迁移和HUVEC细胞的增殖、粘附、迁移及小管形成,提示CIAPIN1可抑制胃癌细胞的侵袭、转移及血管生成,可能在胃癌转移及血管生成过程中发挥重要作用;3.Western-Blot结果显示CIAPIN1可抑制CDC42、VEGF、HIF-1α、IL-8等血管生成相关分子的表达水平,提示CIAPIN1可抑制胃癌血管生成,其机制部分是通过抑制HIF-1α和VEGF的表达来实现的。CIAPIN1作为一个凋亡相关新基因,在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用,我科既往研究发现CIAPIN1调控胃癌增殖和耐药,但其介导胃癌侵袭、转移、血管生成的作用尚未见报道,本研究首次发现CIAPIN1与胃癌转移及血管生成密切相关,其抑制血管生成的机制部分是通过抑制HIF-1α和VEGF的表达来实现的;并可能存在两条信号通路,一是CIAPIN1直接作用于VEGF从而发挥抑制胃癌血管生成的作用,二是CIAPIN1通过对HIF-1α作用之后间接作用于VEGF即介导HIF-1α/VEGF信号通路从而抑制胃癌的血管生成。但上述结果还需要更进一步的研究证实,以期为CIAPIN1作为胃癌临床治疗靶标奠定坚实的理论基础。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

【参考文献】