Dickkopf 1影响非小细胞肺癌细胞迁移与侵袭能力的机制研究

发布时间：2019-03-30 19:21

【摘要】：背景:肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常见的类型,占肺癌总数的80-85%,严重威胁人类的健康。虽然手术、放疗、化疗等治疗方法的不断改进在NSCLC患者的治疗方面有了一定的提高,但患者的预后仍不尽人意,侵袭转移仍然是影响患者生存质量及预后的重要因素。近年来,有多项研究表明Dickkopf 1(DKK1)的表达与肺癌的发生发展密切相关,但影响机制仍不清楚。目的:本研究从细胞水平探讨DKK1在NSCLC迁移与侵袭能力中的作用,并探索其具体的影响机制。方法:本研究选择NSCLC细胞系H1299及95C两种细胞系,采用慢病毒载体转染贴壁细胞的方法构建DKK1低表达及其对照细胞模型,即H1299-DKK1-KD与H1299-NC、95C-DKK1-KD与95C-NC,荧光显微镜下观察感染效果并用Western-blot检测DKK1的表达以确认感染效果;采用划痕和Transwell实验检测细胞的迁移与侵袭能力;采用Western blot实验检测NSCLC细胞系中上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白、β-catenin及磷酸化β-catenin的表达;应用Wnt信号通路抑制剂IWP2降低β-catenin的表达并检测IWP2对EMT、细胞迁移与侵袭能力的影响,以确认β-catenin在DKK1诱导的EMT、细胞迁移与侵袭能力中的关键作用;应用GSK3β抑制剂Li Cl抑制β-catenin的磷酸化,以恢复β-catenin的表达并检测Li Cl对EMT、细胞迁移与侵袭能力的影响;采用细胞免疫荧光实验检测β-catenin的亚细胞分布情况。结果:1.细胞荧光检测结果表明,85%的细胞成功感染DKK1-sh RNA或NS(non-silencing)-sh RNA;Western-blot结果显示,与未经转染的细胞及转染NS-sh RNA的细胞相比,转染DKK1-sh RNA的细胞中DKK1的表达明显下降。以上结果均提示,已成功构建DKK1低表达(DKK1 knockdown,KD)模型H1299-DKK1-KD和95C-DKK1-KD,以及空载对照(negative control,NC)细胞模型H1299-NC和95C-NC。2.细胞划痕实验结果显示,划痕24h后,H1299-DKK1-KD组细胞的划痕愈合面积明显低于H1299及H1299-NC组,95C-DKK1-KD细胞的划痕愈合面积明显低于95C及95C-NC组;Transwell细胞迁移实验结果显示,与H1299及H1299-NC组细胞相比,H1299-DKK1-KD组细胞过膜细胞数明显降低,与95C及95C-NC细胞相比,95C-DKK1-KD细胞的过膜细胞数明显降低。以上结果表明,敲降DKK1的表达降低了NSCLC细胞的迁移能力。3.Transwell细胞侵袭实验结果显示,与H1299及H1299-NC组细胞相比,H1299-DKK1-KD组细胞穿透Matrigel胶并侵袭到小室下侧的细胞数目明显降低;与95C及95C-NC细胞相比,95C-DKK1-KD细胞的过膜细胞数也明显降低。以上结果表明,敲降DKK1的表达降低了NSCLC细胞的侵袭能力。4.Western-blot检测DKK1对EMT相关蛋白表达的影响,结果显示,与H1299及H1299-NC细胞相比,H1299-DKK1-KD细胞的ZEB1及Snail表达水平明显降低;在95C细胞系中,与95C及95C-NC细胞相比,95C-DKK1-KD细胞中ZEB1及Snail的表达水平明显降低。以上结果提示,DKK1诱导EMT的发生。5.Western-blot检测DKK1对β-catenin表达的影响,结果显示,与H1299及H1299-NC细胞相比,H1299-DKK1-KD细胞中β-catenin表达水平降低,且β-catenin的磷酸化水平明显提升;在95C细胞系中,与95C及95C-NC细胞相比,95C-DKK1-KD细胞中β-catenin的表达水平明显降低,且β-catenin的磷酸化水平明显提升。以上结果提示,DKK1并未抑制经典Wnt/β-catenin信号通路,而是通过其他途径提升了β-catenin的表达。6.应用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWP2抑制β-catenin的表达,检测IWP2对EMT、细胞迁移与侵袭能力的影响,结果显示,DKK1表达水平相对较高的H1299和H1299-NC细胞,在经IWP2作用后,EMT相关蛋白表达水平、细胞迁移与侵袭能力均下降;同样地,DKK1表达水平相对较高的95C和95C-NC细胞,在经IWP2作用后,EMT相关蛋白表达水平、细胞迁移与侵袭能力均下降。以上结果提示,IWP2有效地抑制了β-catenin的表达,同时有效地抑制了DKK1诱导的EMT、细胞迁移与侵袭。7.应用GSK3β抑制剂Li Cl抑制β-catenin的磷酸化,以恢复β-catenin的表达,同时检测Li Cl对EMT、细胞迁移与侵袭能力的影响,结果显示,H1299-DKK1-KD及95C-DKK1-KD细胞经Li Cl作用后,EMT相关蛋白的表达水平、细胞的迁移与侵袭能力均有所恢复。以上结果提示,Li Cl明显消减了DKK1-KD对EMT相关蛋白、细胞迁移与侵袭能力的抑制作用。8.细胞免疫荧光检测结果显示,β-catenin在细胞膜、细胞质、细胞核中均有分布,与NC细胞组相比,DKK1-KD细胞组中,核β-catenin的表达明显降低。结论:1.DKK1的下调明显抑制EMT发生,并抑制NSCLC细胞的迁移与侵袭能力。2.DKK1的表达与β-catenin表达呈正相关关系,DKK1的下调促使β-catenin发生磷酸化进行降解。3.β-catenin在DKK1诱导的EMT、细胞迁移与侵袭过程中发挥至关重要的作用。4.DKK1通过抑制β-catenin发生磷酸化的过程而实现对β-catenin的调控。5.DKK1稳定核内β-catenin的表达,进而实现对EMT、细胞迁移与侵袭过程的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】