ARHGEF7促进肝细胞癌侵袭转移的作用及机制研究

发布时间：2019-04-03 07:33

【摘要】：研究背景肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是全世界最常见及预后恶劣的恶性肿瘤之一,严重威害着人类的生命健康。而HCC病人术后具有极高的复发转移是导致其死亡率较高的的重要因素。因而,进一步系统深入开展HCC侵袭转移的功能及机制研究将有助于探索新的HCC治疗措施与手段,对进一步提高HCC的治疗效果具有重要的意义。ARHGEF7是鸟嘌呤核苷酸交换因子家族中重要一员,近年来研究发现其通过调节细胞间粘附点及促进伪足的突出,影响细胞的运动、增殖及凋亡,从而诱导血管通透性改变,最终导致肿瘤的形成。进而有研究提示胃癌细胞中ARHGEF7表达水平明显高于癌旁和正常组织；ARHGEF7可通过激活Yap/Taz并使其过度表达从而促进乳腺癌的增殖及迁移；ARHGEF7在肾癌细胞中的蛋白表达水平明显高于HEK293细胞。这些皆提示ARHGEF7在恶性肿瘤的发生发展中可能发挥极其重要的作用。我们前期的初步研究也表明ARHGEF7 mRNA和蛋白质水平在HCC组织表达明显高于相应癌旁组织和正常HCC组织,且与HCC肿瘤多发结节、Edmondson-Steiner分级及伴有静脉浸润密切相关。这些提示了ARHGEF7可能参与HCC的发生发展过程,但具体的作用机制目前尚不明确。因此,本研究我们在分析HCC组织中ARHGEF7表达情况的基础上,进而研究其在多种不同侵袭转移能力的肝癌细胞系中的表达情况,并针对高表达ARHGEF7的细胞株通过慢病毒介导的sh-RNA干扰技术抑制其表达,通过一系列体内外实验研究ARHGEF7促进HCC侵袭转移的作用及可能分子机制。目的及意义研究人HCC组织及细胞中ARHGEF7的表达情况,探讨其与HCC临床病理特征和预后的关系,通过慢病毒感染技术构建抑制ARHGEF7的ARHGEF7细胞系,并通过体内外实验进一步研究ARHGEF7在HCC中的生物学作用。这些研究为阐明ARHGEF7促进HCC侵袭转移的具体作用机制奠定基础,并为后续研发针对HCC靶向治疗新的高效靶点提供全新的思路和方法。方法和结果1.ARHGEF7 mRNA和蛋白在HCC组织中高表达并与临床病理特征和预后密切相关首先运用实时定量PCR(QRT-PCR)技术检测30例新鲜的HCC组织及其对应的邻近非瘤肝组织(Adjacent Normal Liver Tissues,ANLT),5例相对正常肝组织(Normal Liver Tissues,NL)中ARHGEF7 mRNA的表达水平。结果显示,HCC中ARHGEF7 mRNA表达丰度明显高于ANLT及NL(P0.01)。进而采用Western blot方法检测同一批组织标本。结果显示,ARHGEF7蛋白在HCC中的相对表达水平也明显高于相应的ANLT和NL(P0.01)。进一步分析HCC中ARHGEF7的mRNA与蛋白表达强度的相关性时,结果提示HCC组织中ARHGEF7的mRNA表达水平与其蛋白表达水平呈显著的正相关(r=0.843,P0.01),HCC中ARHGEF7的mRNA表达水平越高,ARHGEF7的蛋白表达水平也越高。进而将HCC组织标本按不同的临床病理特征进行分组并比较组间ARHGEF7 mRNA及蛋白的表达差异,结果显示ARHGEF7 mRNA及蛋白的表达水平均与有无包膜、结节数目、TNM分期、Edmondson-Steiner分级及静脉浸润等临床病理特征密切相关(P0.05)。2. ARHGEF7在HCC细胞系中高表达并与其侵袭转移能力密切相关为验证我们在手术切除新鲜HCC组织中的结果,我们采用QRT-PCR方法检测了ARHGEF7 mRNA在六种不同侵袭转移能力的肝癌细胞系：HepG2、 SMMC-7721、Huh-7、MHCC-97L、MHCC-97H和HCCLM3的表达情况,并采用正常的肝细胞系HL-7702作为对照细胞。结果显示ARHGEF7 mRNA在六种不同侵袭转移能力的肝癌细胞系中的表达强度明显高于HL-7702,提示其在肝癌细胞系中的表达强度随侵袭转移能力的增强而升高。我们进一步采用Western blot方法检测了ARHGEF7蛋白在肝癌细胞系中的表达水平。结果显示,ARHGEF7蛋白在这六种肝癌细胞系中的表达明显高于其在HL-7702中的表达水平,差异具有显著性意义(任意两者之间P0.05)。3. Training cohort中ARHGEF7高表达与肝癌临床病理特征及预后的关系我们在Training cohort组中采用免疫组化方法(IHC)检测92例HCC石蜡组织标本中ARHGEF7的表达情况并分析其与HCC临床病理特征的关系。结果表明,ARHGEF7主要分布于细胞浆内,ARHGEF7的高表达与HCC有肝硬化、包膜形成、多个肿瘤结节、TNM分期高及Edmondson-Steiner分级高密切相关(P0.05)。ARHGEF7高表达组HCC病人的中位总体生存时间明显短于ARHGEF7低表达组,总体生存率亦明显低于ARHGEF7低表达组(P=0.001)。与之相似,ARHGEF7高表达组的中位无瘤生存时间明显短于低表达组,其无瘤生存率也显者低于ARHGEF7低表达组(P=0.003)。我们进而针对总生存时同及无瘤生存时间利用临床随访资料建立Cox比例风险回归模型并进行分析。总生存时间组进行单因素Cox回归分析时,发现有无肝硬化、是否有包膜、肿瘤结节数、TNM分期、Edmondson-Steiner分级及ARHGEF7表达水平这6项因素与HCC病人的预后相关；但进一步行多因素Cox回归分析时,发现有无肝硬化、肿瘤直径、Edmondson-Steiner分级、是否存在静脉侵犯及ARHGEF7表达水平这5项成为影响HCC预后的独立危险因素。而无瘤生存时间组进行单因素Cox回归分析时,发现有无肝硬化、是否有包膜、肿瘤结节数、Edmondson-Steiner分级及ARHGEF7表达水平这5项因素与HCC病人的预后相关；进一步行多因素Cox回归分析时,肿瘤直径及ARHGEF7表达水平这2项成为影响HCC预后的独立危险因素。4. Validation cohort中ARHGEF7高表达与肝癌临床病理特征及预后的关系为了验证前面结果,我们进而在Validation cohort组中采用IHC检测65例HCC石蜡组织标本中ARHGEF7的表达情况并分析其表达水平与临床病理特征的关系。结果发现,ARHGEF7主要分布在细胞浆内,ARHGEF7的高表达与HCC无包膜形成、多个肿瘤结节、TNM分期、Edmondson-Steiner分级及静脉浸润密切相关(P0.05)。ARHGEF7高表达组HCC病人的中位总体生存时间明显短于ARHGEF7低表达组,总体生存率亦明显低于ARHGEF7低表达组(P=0.009)。与之相似,ARHGEF7高表达组病人的中位无瘤生存时间显著短于低表达组,其无瘤生存率也明显低于低表达组(P=0.005)。我们进一步针对总生存时间及无瘤生存时间利用临床随访资料建立Cox比例风险回归模型。总生存时间组进行单因素Cox回归分析时,发现是否存在包膜、肿瘤结节数、Edmondson-Steiner分级、是否存在静脉浸润及ARHGEF7表达水平这5项因素与HCC病人的预后非常相关；进一步行多因素Cox回归分析时,发现肿瘤结节数、TNM分期、是否存在静脉侵犯及ARHGEF7表达水平这4项成为影响HCC预后的独立危险因素。而无瘤生存时间组进行单因素Cox回归分析时发现,是否存在包膜、肿瘤结节数、Edmondson-Steiner分级、静脉浸润及ARHGEF7表达水平这5项因素与HCC病人的预后非常相关；多因素Cox回归分析时发现,结节数目、TNM分期、静脉浸润及ARHGEF7表达水平这4项成为影响HCC预后的独立危险因素。5.通过慢病毒所介导的sh-RNA敲低HCCLM3细胞系中ARHGEF7的表达进而我们选择了一种具有较高侵袭转移能力的HCCLM3细胞,作为我们后续进一步研究HCC功能及机制实验的细胞,通过慢病毒感染技术,构建抑制ARHGEF7的ARHGEF7细胞系(KD组)和对照组HCCLM3vector细胞系(NC组)。感染后72h后观察到细胞荧光分布达到90%以上,且未观测到大面积细胞死亡的现象。接着采用QRT-PCR检测ARHGEF7在HCCLM3细胞系中的表达水平,结果发现KD组细胞中的ARHGEF7 mRNA水平较NC组明显降低,敲低效率达到83.3%(P0.05)。进一步采用WB法检测HCCLM3中ARHGEF7蛋白水平的表达。结果表明KD组ARHGEF7蛋白表达量明显低于NC组(P0.05)。证明慢病毒能够有效感染靶细胞,且很好的抑制HCCLM3HCC细胞系中ARHGEF7的表达,为后续研究该基因的功能及机制试验奠定基础。6.体外抑制ARHGEF7的表达可以抑制肝癌细胞侵袭迁移并降低其黏附能力我们采用划痕愈合实验、Transwell侵袭小室实验来检测ARHGEF7在体外对肝癌细胞的迁移运动能力。划痕愈合实验结果显示：NC组和KD组细胞8小时平均迁移率无明显差异(P0.05),而两组细胞24小时平均迁移率则存在明显差异(P0.05),提示抑制ARHGEF7表达后HCCLM3迁移运动能力显著下降。Transwell侵袭小室实验结果显示KD组细胞穿透的细胞数量明显较NC组细胞减少(P0.05)。另外,我们采用细胞骨架免疫荧光染色来检测抑制ARHGEF7后对肝癌细胞形态学方面的影响,我们观测到NC组肝癌细胞的形态相比KD组肝癌细胞肌动蛋白细胞骨架发生显著的改变。根据文献报道ARHGEF7与细胞粘附之间存在相互联系,我们进一步采用同质性和异质性粘附实验明确ARHGEF7是否可调控肝癌细胞的粘附作用。结果提示KD组细胞的同质性粘附能力比NC组明显增强(P0.05),而KD组细胞异质性粘附能力则明显减弱(P0.05)。以上结果表明,抑制ARHGEF7的表达可在体外影响肝癌细胞的粘附作用并可抑制其侵袭转移。7.体外抑制ARHGEF7的表达不影响肝癌细胞的增殖和凋亡接着我们采用MTT法对细胞生长进行计数,并绘制生长曲线,以期验证ARHGEF7对于肝癌细胞增殖的影响。结果显示：KD组与NC组细胞在第7天的细胞计数差别无统计学意义,其增殖能力无明显区别(P0.05)。我们又通过集落形成实验来检测ARHGEF7对肝癌细胞在体外形成集落的能力。结果提示ARHGEF7不能有效促进肝癌细胞的集落形成,KD组细胞的集落形成数与NC组细胞无明显差异(P0.05)。为了进一步验证ARHGEF7是否对肝癌细胞体外的生长具有作用,我们采用流式细胞技术检测KD组及NC组的细胞周期,结果提示相比NC组,KD组处于G2/M期的细胞增加(P0.05),处于S期的细胞减少(P0.05),处于G1期的无显著变化(P0.05)。结果表明ARHGEF7不能有效促进肝癌细胞体外的增殖。进而我们采用流式细胞检测NC和KD组HCCLM3细胞的凋亡情况。结果显示相比NC组,KD组细胞无明显凋亡(P0.05)。以上结果表明ARHGEF7在体外不影响其增殖凋亡。8.裸鼠皮下成瘤体内抑制ARHGEF7的表达可以抑制肝癌细胞的增殖和转移我们通过建立HCCLM3裸鼠原位种植模型,来在体内环境研究抑制ARHGEF7后对肝癌细胞侵袭转移能力的影响,我们分别将NC组和KD组HCCLM3细胞分别种植在裸鼠皮下,观察并比较NC组和KD组细胞原位种植瘤的生长情况及肺部转移情况。结果显示,KD组裸鼠皮下原位种植瘤的平均体积明显小于NC组(P0.05)。我们将KD组和NC组的皮下种植瘤剥离后固定包埋,并分别切片行HE染色及免疫组化法检测两组种植瘤中ARHGEF7的表达情况。结果提示,KD组种植瘤组织中ARHGEF7的表达水平明显低于NC组,验证了我们慢病毒感染的有效性。我们进一步将NC组及KD组裸鼠的肺组织行连续切片并行HE染色,比较两组细胞肺转移的潜能。结果提示,NC组5只裸鼠中有4只发生了肺转移,而KD组5只裸鼠中仅有1只发现肺转移灶,两组间比较具有显著性差异(P0.05)。这些结果表明,慢病毒抑制ARHGEF7的表达后,肝癌细胞在体内的成瘤能力和转移能力被显著抑制。9.裸鼠原位成瘤体内抑制ARHGEF7的表达可以抑制肝癌细胞的增殖和转移将前期两组原位裸鼠成瘤形成的皮下肿瘤组织分别取出切碎并种植于另外两组裸鼠(各10只)的肝脏被膜下,观察并比较NC组和KD组肝脏原位种植瘤成瘤能力及最后体积。结果提示,NC组10只裸鼠均形成了肝脏肿瘤,而KD组10只裸鼠中只有7只形成肝脏肿瘤,且NC组肝脏原位种植瘤的平均相对体积明显大于KD组(P0.05)。进而我们将NC组和KD组的肝脏种植瘤制作石蜡切片,分别行HE染色及免疫组化法检测两组肝脏种植瘤组织中ARHGEF7的表达。结果发现,NC组肝脏种植瘤组织中ARHGEF7的表达水平明显高于KD组,这进一步验证了我们慢病毒所介导的sh-RNA抑制的有效性。更有意思的是,我们的结果显示NC组的10只裸鼠中有8只在种植部位以外的肝脏组织发现了肿瘤结节(即肝内转移),而KD组的10只裸鼠中仅有2只存在肝内转移,两组间比较具有显著性差异(P0.05)。进而,我们将NC组和KD组裸鼠的肺组织连续切片行HE染色并镜检,比较两组细胞发生肺转移的能力。结果显示,NC组裸鼠中有5只发生了肺转移,而KD组裸鼠仅有1只出现肺转移,两组比较具有显著意义(P0.05)。上述结果进一步显示,ARHGEF7的表达被抑制后,裸鼠肝内及肺转移均明显减少,肝癌细胞在体内的成瘤能力和转移能力被显著抑制。主要结论1. ARHGEF7在肝癌组织和肝癌细胞系中的mRNA与蛋白表达水平均明显上调；2. ARHGEF7在肝癌组织中的高表达与肝硬化、包膜形成、结节数目、TNM分期、Edmondson-Steiner分级及静脉浸润等临床病理特征密切相关,是影响肝癌病人预后的独立危险因素；3.体外抑制ARHGEF7的表达可抑制肝癌细胞的侵袭转移并影响其黏附能力,但不影响肝癌细胞的增殖和凋亡；4.体内抑制ARHGEF7的表达可以抑制肝癌细胞的增殖和转移；5. ARHGEF7可作为一个判断肝癌病人预后的潜在标志物及针对肝癌复发转移的潜在治疗靶点。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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