ITGA1在结直肠肿瘤表达中的相关研究

发布时间：2019-04-13 12:35

【摘要】：目的探讨整合素α1(ITGA1)在结直肠腺瘤癌组织、血清及5系结直肠肿瘤细胞株中的表达情况;构建ITGA1过表达及抑制性载体,包装慢病毒,体外实验验证ITGA1的表达水平变化对结直肠肿瘤癌生物学行为的影响。明确其在结直肠肿瘤发生、发展中的机制,判断其是否可作为结直肠肿瘤治疗新的靶点。方法1.Western Blot检测ITGA1在5种结直肠肿瘤细胞系中的表达情况,同时检测其在结直肠正常、腺瘤、癌组织中的表达情况,分析比较两种表达情况,结合组织的临床病理分型进行分析。2.免疫组织化学法(IHC)检测结直肠肿瘤(CRC)患者正常组织及肿瘤组织中ITGA1的表达情况。3.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测肿瘤患者及健康人群血清中ITGA1的浓度。4.构建ITGA1的过表达载体并包装慢病毒,转染NCM460(正常肠上皮细胞)细胞,构建ITGA1的抑制表达载体并包装慢病毒,转染SW480(原位癌细胞)细胞,并筛选出稳定表达的细胞株。5.Transwell及划痕实验分别检测ITGA1对细胞增殖和迁移的影响。6.体外裸鼠成瘤实验验证细胞学实验结果。结果1.Western Blot检测ITGA1在NCM460(正常肠上皮细胞)、SW480(原位癌细胞)、SW620(淋巴结转移结肠癌细胞)、HCT116(原位癌细胞)、HT29(原位癌细胞)细胞系中的表达,通过ImageJ专业软件分析后可以看出,ITGA1在正常长肠上皮细胞NCM460(灰度值310±4.3)中低表达,在肿瘤细胞系SW480(灰度值949.4±48.3)、sw620(灰度值414.2±10.5)、hct116(灰度值557.0±46.0)、ht29(灰度值367.4±2.4)中有不同程度的高表达,量化灰度值之后差异具有统计学意义(p0.01)。2.westernblot检测itga1在结直肠肿瘤患者正常组织、癌旁组织、腺瘤组织及肿瘤组织中的表达,通过imagej及primer5.0专业软件分析后可以看出itga1在正常组织(101.2±1.7)中低表达,在癌旁组织(307.2±56.7)、腺瘤组织(1015.0±13.8)及肿瘤组织(2749.0±15.7)中有不同程度的高表达,结果与细胞系表达情况一致。3.real-timepcr结果与westernblot结果一致,验证了我们前期的实验成果。4.免疫组化:正常组织itga1阳性细胞数为985±683个/每视野,肿瘤组织itga1阳性细胞数为4888±2612个/每视野,正常组织与肿瘤组织中itga1阳性细胞数差异具有统计学意义(p0.01)。结直肠肿瘤组织中itga1阳性强度:弱阳性(+)7例,中等阳性(++)21例,强阳性(+++)12例。5.elisa:正常人群血清中itga1的浓度为(1.79±0.43)μg/ml,结直肠肿瘤患者血清中itga1的浓度为(4.19±1.82)μg/ml。正常人群与结直肠肿瘤患者血清中itga1的浓度差异具有统计学意义(p0.01)。肿瘤患者血清样本中itga1的浓度在性别,年龄,发病部位,duke's分期(abcd期),及结直肠肿瘤标志物癌胚抗原(carcino-embryonicantigencea),ca125(糖类抗原)中的浓度差异无统计学意义(p0.05)。在tnm(i,ii,iii,iv期)分期,ca199(糖类抗原)中的浓度差异具有统计学意义(p0.05)。肿瘤患者血清中itga1的浓度与cea之间存在着正相关关系(r=0.516)。与肿瘤标志物ca125(糖类抗原),ca19-9(糖类抗原)之间的相关性较低。6.稳定转染itga1慢病毒,westernblot检测itga1在转染病毒细胞中的表达情况,通过imagej专业软件分析后可以看出,过表达ncm460细胞(592.9±65.9)较正常ncm460细胞(425.8±37.6)itga1的表达量升高,干扰sw480细胞(7.7±3.4)较正常sw480细胞(120.9±4.8)itga1的表达量降低。说明itga1在结直肠正常及肿瘤细胞中有一定的影响作用。7.transewll结果显示,sw480细胞转染干扰性病毒后侵袭能力较正常sw480细胞有所降低。正常SW480细胞侵袭数目为(134±5),Anti-ITGA1-SW480细胞侵袭数目为(116±2),两组比较差异具有统计学意义(p0.05)。说明ITGA1对细胞的侵袭能力有所影响。8.划痕实验结果显示,与正常NCM460细胞相比,过表达NCM460细胞迁移能力明显高于正常NCM460细胞。与正常SW480细胞相比,Anti-ITGA1-SW480细胞迁移能力低于正常SW480细胞。差异均具有统计学意义(p0.05)。说明ITGA1对细胞的迁移能力有所影响。9.裸鼠成瘤实验及免疫组化Ki67实验表明:正常肠上皮细胞NCM460成瘤组织中Ki67表达几乎为阴性,过表达NCM460成瘤组织中有弱阳性表达。SW480成瘤组织中阳性细胞数为(8187±2137),Anti-ITGA1-SW480成瘤组织中阳性细胞数为(7105±1994),差异具有统计学意义(P0.01)。说明ITGA1在细胞的成瘤过程中起着一定的作用。结论ITGA1在结直肠肿瘤细胞系、组织及血清中均高表达,抑制ITGA1的表达可相对降低肿瘤细胞的侵袭、迁移及增值能力,整合素α1(ITGA1)可能在结直肠肿瘤的发生发展中有着重要的调控作用,并有可能作为抑制结直肠肿瘤发生发展的重要靶点。
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【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

【参考文献】