RBBP4在肝细胞肝癌中的表达及作用机制研究

发布时间：2019-04-16 15:51

【摘要】：背景：肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)在我国消化系统恶性肿瘤中属于高发肿瘤。我国是乙肝感染大国,这就造成了每年我国HCC的新增病例和死亡人数均居世界首位。然而由于肝癌发病比较隐蔽,恶性度高,进展很快,这些特性造成肝癌预后极差,给人民的健康和社会经济带来沉重负担。近年来随着医学事业的发展,肝癌治疗观念不断更新,以手术为主的综合治疗策略在一定程度上提高了肝癌患者生存率。特别是近年来以肝移植为代表的新的治疗方式的出现为彻底根治肝癌提供了可能,然而由于术后肝癌的复发转移大大阻碍了肝移植病人的中长期存活。因此,寻找更有效的肝癌移植预后分子标志物,探讨其在肝癌发生发展中的作用机制将会有效地提高肝癌患者的长期生存率。目的：本研究旨在利用蛋白质组学双向电泳技术筛选肝癌肝移植术后复发病人HCC组织与未复发肝癌肝移植病人HCC组织间差异表达的蛋白质,通过生物信息学分析以及文献检索寻找出与肝癌肝移植病人术后复发以及与HCC复发转移可能密切相关的潜在分子标志物。对筛选出的潜在分子标记物RBBP4首先在多样本肝癌肝切病人及肝癌肝移植病人HCC组织和配对癌旁组织进行表达验证,分析其与移植病人临床病理参数以及肝病人预后的关系。最后通过分子生物学和细胞生物学技术,进一步明确RBBP4在HCC细胞株中的生物学功能,探究其在HCC复发转移中的可能分子机制。方法： 1.利用双向电泳联合质谱技术(two-dimensional gel electrophoresis combined mass spectrum,2D-MS)筛选肝癌肝移植术后复发病人HCC组织与移植术后未复发病人HCC组织间差异表达蛋白,并鉴定。 2.收集30例HCC患者肝癌肝切病人肿瘤及配对癌旁冰冻组织,以及70例肝癌肝移植病人肿瘤及配对癌旁石蜡组织,利用Western免疫印迹、实时荧光定量PCR、免疫组化等技术验证差异表达蛋白视网膜母细胞瘤结合蛋白4(RBBP4)在’HCC肿瘤组织及配对癌旁组织中的表达情况。同时检测RBBP4在其他类型肝组织(包括正常肝组织、肝硬化组织、转移性肝癌组织、转移淋巴结组织)中的表达情况。 3.根据免疫组化结果分析RBBP4与肝癌肝移植病人临床病理参数以及病人总体及无瘤生存之间的关系。 4.利用免疫组化检测RBBP4在不同肿瘤类型癌和癌旁组织中的表达,明确RBBP4表达变化是否具有普遍的意义。然后通过构建稳定转染RBBP4干扰及过表达BEL7402和HepG2肝癌细胞株,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式细胞凋亡实验、Transwell细胞侵袭转移实验检测RBBP4在调控肝癌细胞增殖、侵袭转移以及凋亡中的作用。通过体外克隆形成实验和在体裸鼠瘤体生成实验观察RBBP4对HCC细胞体内外成瘤能力的影响。 5.利用microRNA靶基因预测网站结合荧光双报告实验寻找调控RBBP4异常表达的上游microRNA。并利用Western blot,实时荧光定量PCR技术寻找RBBP4调控的下游分子,来探索RBBP4在肝癌复发转移中的分子机制。结果： 1.本实验中,通过2D-MS分析发现RBBP4在肝癌肝移植复发病人癌组织中的表达比未复发病人要高(倍数改变≥2.0倍,p0.05) 2. Western蛋白印迹结果证明RBBP4蛋白在HCC组织中表达水平明显高于配对癌旁组织,实时荧光定量PCR结果也表明RBBP4mRNA水平在HCC组织中表达明显高于配对癌旁组织(p=0.014)。免疫组化结果分析提示RBBP4表达在正常肝、肝硬化、肝癌组织中表达逐渐升高,并且RBBP4在肝癌转移癌组织以及转移的淋巴结组织中也有很高的表达。 3.根据免疫组化结果,临床资料统计分析发现RBBP4蛋白表达水平与肝癌肝移植患者血管侵袭(p=0.027)、肿瘤大小(p=0.01)、pTNM分期(p=0.002)及肿瘤复发(p=0.000)密切相关,与患者性别、年龄、肿瘤数目、甲胎蛋白(AFPA)水平、组织学分级等无关。Kaplan-Mier法分析发现RBBP4高表达患者无瘤生存与总体生存明显低于RBBP4低表达组。Cox多因素回归分析发现RBBP4是肝癌肝移植术后肿瘤复发的独立危险因素(HR=5.425；95%CI=1.803-16.324,p=0.003)。 4.通过进一步的免疫组化检测发现RBBP4在食管癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、肝癌胆管癌中的表达普遍升高。体外细胞功能学实验表明干扰RBBP4表达后,肝癌细胞的增殖能力、侵袭转移能力以及抗凋亡能力降低,而细胞过表达RBBP4后,肝癌细胞的增殖能力、侵袭能力以及抗凋亡能力升高。裸鼠体内成瘤实验表明,干扰RBBP4能够明显减弱肝癌细胞的体内成瘤能力。 5.进一步的分子机制研究证明RBBP4是miR-199a-5p的靶基因,RBBP4的异常升高可能由于miR-199a-5p的表达降低。而RBBP4升高能够通过抑制PTEN表达而激活AKT蛋白,AKT蛋白的活化则又进一抑制了miR-199a-5p的转录。因此我们在肝癌中发现了一条miR-199a-5p/RBBP4/AKT环路,这条环路的激活促进了肝癌的恶性进展。结论： 1.相对于未复发肝癌肝移植病人,RBBP4在肝癌肝移植术后复发病人中的蛋白表达明显升高,这一结果提示RBBP4可能与肝癌肝移植术后肿瘤复发相关； 2.肝癌肝移植病人RBBP4高表达者,其预后要明显差于RBBP4低表达肝癌肝移植患者。RBBP4可能是肝癌肝移植术后肿瘤复发预测的潜在分子标志物； 3. RBBP4在正常肝,肝硬化,肝癌组织中表达逐渐升高,同时RBBP4在多种类型肿瘤中表达普遍升高,提示RBBP4在肿瘤发生发展中可能具有重要意义； 4.在肝癌中存在一条miR-199a-5p/RBBP4/AKT正反馈环路促进肝癌的发生发展。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

【参考文献】