乳腺癌淋巴结转移及病理学相关性microRNA表达谱的建立与验证

发布时间：2019-04-18 15:12

【摘要】：乳腺癌是现阶段女性人群中发病率最高的恶性肿瘤,尤其在发达国家其发病率逐年上升,严重威胁着人类生命。作为癌症恶性表型之一,肿瘤的转移机制是制约着患者预后的桎梏,普遍存在于乳腺癌病例中。由于关于肿瘤细胞发生转移的具体分子机制尚未完全阐明,目前针对乳腺癌转移的特异性治疗手段仍显匮乏。由于乳腺癌淋巴系统丰富,前哨淋巴结转移常发生于乳腺邻近腋下淋巴结。已有研究表明腋下淋巴结转移的发生与乳腺癌患者不良预后密切相关。因此,术后的腋下淋巴结病理检查对于乳腺癌患者是否需要接受术后辅助化疗具有重要的临床指导意义。近年来,得益于钼靶射线检查被广泛应用于乳腺癌的早期诊断,极大地改善了乳腺癌的早起筛查及治疗效果,为乳腺癌患者带来了福音。不仅如此,由于钼靶射线在探查腋窝淋巴结中的应用,在临床实践中腋窝淋巴结转移阴性的患者可以接受针对性的治疗,不再盲目接受乳腺癌淋巴结廓清术。至从钼靶射线在乳腺癌诊断中得到广泛普及,乳腺癌淋巴结廓清术不再是浸润性乳腺癌的统一治疗标准。可见,探究预示早期乳腺癌腋窝淋巴结转移的分子靶标对乳腺癌患者的临床治疗具有重要的参考价值。 microRNA (miRNA)是一类长度约为22m的内源性非编码单链RNA分子,广泛存在于哺乳动物中,在进化过程中呈高度保守。miRNA在细胞内通过组成RISC复合体特异性识别并结合到靶mRNA的3'UTR序列中的miRNA应答元件(miRNA response element, MRE),从而介导靶mRNA分子以及其他转录物的降解或翻译受阻,藉此在细胞的增殖分化、代谢和凋亡等重要细胞生理活动中扮演重要角色。据推测在人类细胞中多达60%的基因受microRNA的调控,迄今人们已发现的microRNA超过1900种。近年来多项有关miRNA与肿瘤相关性的研究中,人们检测到乳腺癌组织中多种miRNA异常表达,并且某些miRNA还与患者预后密切相关。目前已有越来越多的研究表明microRNA在肿瘤发生发展过程中起着重要的调控作用。利用生物信息学手段,检测microRNA表达谱,可以将肿瘤准确的归类于不同的病理亚型及不同阶段。可见,microRNA通过调控靶基因的表达水平在乳腺癌的侵袭转移机制中扮演着重要角色,研究miRNA对靶基因的调控机制对开发针对乳腺癌的早期诊断,预后评估及治疗手段的靶标具有重要的临床意义。然而迄今为止,乳腺癌淋巴结转移相关特异性microRNA表达谱尚未得到充分阐明。本研究中我们采用了通过生物信息学手段建立乳腺癌腋窝淋巴结相关特异性microR NA表达谱,通过软件进行统计学差异分析,筛选乳腺癌腋窝淋巴结转移相关microRNA分子。在73例乳腺癌患者组织样本中检测候选microRNA分子的表达水平,验证这些microRNA与乳腺癌腋窝淋巴结转移之间的相关性。此外,鉴于目前三阴乳腺癌的诊疗成为乳腺癌领域中的热点问题,我们检测了Her-2/neu, ER及PR的表达情况,并与候选microRNA的表达水平进行匹配分析。收集2011年12月和2012年3月期间在我院行乳腺癌根治术的73例临床组织样本(31例发生淋巴结转移的病例及42例未发生过淋巴结转移的病例),根据是否发生淋巴结转移进行分组,即淋巴结转移组(N=31)及未转移组(N=42),入组患者年龄38-65岁之间,中位数为49,且均为女性。两组样本收集完成后立即冻存于液氮,直至提取RNA。本研究中涉及的临床相关性实验均得到吉林大学第二医院伦理委员会的许可,并征得患者知情同意书。该研究所用的标本所属患者均无术前放、化疗史。利用microRNA芯片技术高通量检测microRNA表达谱改变情况,进行两组之间的对比,并将Her-2是否阳性作为变量与microRNA表达情况进行对比。提取样本组织中总RNA,进行逆转录后,对(miR-185-5P, miR-339-5p, miR-542-5P, miR-3923)进行实时定量PCR,从而验证这些miRNA表达的。通过统计学分析,对microRNA表达水平与临床病理特征之间的关系相关性进行统计学分析。在试验方法上我们采用mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Cat. No. AM1560; Ambion, Austin, TX, USA),按照厂商提供的说明书及操作指南进行RNA提取分离及纯化,并通过Agilent生物分析仪2100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)检测RIN数由,进行RNA质检。microRNA芯片是Agilent human miRNA array (8*60K, version16.0; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA),其中包含针对在数据库中的miRBase注册的1205人的microRNA序列(ROM捕获探针www.mirbase.org)。按昭miRNA Complete Labeling and Hyb Kit (Cat. No.5190-0456; Agilent Technologies)的操作指南在55℃条件下进行RNA杂交,离心20rpm,20小时。杂交后, staining dishes (Cat. No.121; Thermo Shandon, Waltham, MA, USA)进行染色,并在Gene Expression Wash Buffer Kit (Cat. No.5188-5327; Agilent Technologies)清洗。最后应用Feature Extraction software10.7(Agilent Technologies)及Raw data were normalized by Quantile algorithm, Gene Spring Software11.0(Agilent Technologies)进行标准化分子。使用SYBR绿色荧光标记的实时RT-PC R检测在microRNA array中表达呈显著差异的microRNA分子。将50μg的总RNA用microRNA的cDNA合成试剂盒(Takara Life Technologies, Japan)进行反转录。用nicroRNA序列特异性引物(Takara Life Technologies Inc, Japan)进行单个microRNA的表达水平的测定。所使用的RT-PCR条件为：95℃30sec,95℃10sec,60℃25sec,35cycles。计算出相对内参的2-△△Ct值,对microRNA的表达水平进行相对定量。人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231购自ATCC。培养于含10%胎牛血清的完全培养基(HyClone, USA),(?)入双抗：100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素,在在37℃、湿润、含有5%CO2密闭条件下培养。细胞在完全培养基中呈贴壁生长。下面分别从广州Ribo-Bio生物科技有限公司购买,microRNA类似物,microRNA空白对照及阴性对照microRNA, microRNA的抑制剂,具有互补序列的成熟microRNA,阴性对照的microRNA抑制剂。乳腺癌细胞系n(?)DA-MB-231以3×105/孔的密度接种于6孔板中,培养过夜。然后将细胞用20nM的类似物(miR-339-5p、miR-3923的类似物)或40nM的抑制剂(miR-185-5p和miR-542-5p的抑制剂)应用Lipofectamine2000进行转染制造商的指示。48小时后,进行定量RT-PCR验证转染效率并进行transwell小室试验观察细胞侵袭转移能力。应用Matrigel invasion assay (Becton Dickinson, Bedford, MA, USA)进行Transwell侵袭试验。所用8m m大小的transwell室插入物涂覆有基质胶的1mg/ml的无血清DMEM培养基。细胞用胰蛋白酶处理,以每孔1×105个细胞密度,加入到3个复孔中。Franswell小的下部腔室中用750ml含0.5%血清作为趋化因子的培养基填充,在shRNA转染后,并使其在37℃下孵育48小时。在通过滤膜的细胞进入下层,侵入matrigel胶,戊二醛进行固定,并用结晶紫染色,拍照记录。实验获得的数据均采用SPSS17.0统计软件包处理,应用Excel作图,用F检验首先进行方差分析,以t检验判断差异显著性。通过微阵列分析我们发现共有17个microRNA的表达水平在两组患者组织中呈显著性差异。与非淋巴结转移组的患者组织相比,淋巴结转移组中miR-206, miR-3923, miR-181A, miR-92A, miR-421, miR-339-5p, miR-3196, miR-29b等表达水平显著下调(超过1.5倍),而miR-542-5p, miR-200a, miR-564, miR-451, miR-30c, miR-200b, miR-191-3P,miR-142-5p以及miR-185-5p等microRNA分子则呈高表达状态。其中miR-185-5p, miR-542-5p, miR-339-5p和miR-3923等4个microRNA分子的表达呈显著性差异。其中miR-185-5p, miR-542-5p的表达水平在淋巴结转移组中显著高表达(P=0.002和P=0.000),而1niR-339-5p(?)miR-3923的表达水平在淋巴结转移组显著下调(P=0.000和P=0.000)。为了在体外水平观察候选microRNA分子在肿瘤转移过程中的功能,我们应用qRT-PCR检测候选microRN A在乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中的表达水平,结果表明,miR-339-5p和miR-3923在MDA-MB-231细胞中显著低表达(分别为P=0.002和P=0.001),而miR-542-5p在4DA-MB-231细胞中显著高表达(P=0.026)。miR-185-5p在不同临床分期的患者之间的表达不同,但并无显著性差异(采用Mann-Whitney U检验,P=0.051)。为了研究这些microRNA是否能影响乳腺癌细胞的侵袭能力我们进行了Transwe11试验。结果表明,miR-339-5p和miR-3923的体外高表达显著抑制IDA-MB-231细胞的转移能力。在该研究中一些microRNA的表达与其他临床病理特征,包括肿瘤大小,临床分期,绝经状态,ER,PR,HER2表达情况无明显相关性(采用Mann-WhitneyU检验, P0.05)。综上,我们的实验结果表明miR-185-5p, miR-542-5p, miR-339-5p和miR-3923等microRNA的表达水平与乳腺癌的淋巴结转移密切相关,作为乳腺癌的预后评估靶标,具有重要的临床指导意义。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【共引文献】