【摘要】：目的:观察改变mi RNA-21表达对人肺癌细胞体外生长和迁移中的作用,并探讨其分子机制。方法:第一部分利用分子克隆技术构建mi RNA-21过表达载体(命名为p-mi R-21);体外将p-mi R-21和前期构建的pc DNA-6.2-mi RNA-21-ASOs(命名为p-mi R-21-ASOs)载体瞬时转染入人肺癌95D细胞中;Real-time PCR技术检测mi R-21成熟体的表达水平,肿瘤细胞生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6,以及肿瘤细胞转移相关分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表达变化;利用CCK-8和Scratch assay检测改变mi R-21表达对人肺癌95D细胞体外增殖和迁移的影响;利用Transwell技术检测95D细胞的迁移和侵袭能力变化;最后利用Western blot检测相关信号途径,包括Akt/m TOR、Erk等途径的传递改变。第二部分运用生物信息学技术初步筛选出mi R-21可能的候选靶分子;Real-time PCR检测p-mi R-21-ASOs和p-mi R-21转染入人肺癌95D细胞后,候选靶分子的表达变化;Western blot技术验证其表达。利用RNAi技术合成mi R-21靶分子LEMD3的RNAi干扰序列(命名为si-LEMD3),体外瞬时转染入人肺癌95D细胞;Real-time PCR和Western blot技术检测细胞中LEMD3的表达变化;CCK-8法和Scratch assay观察干扰LEMD3表达后对95D细胞体外增殖和迁移的影响;克隆形成实验观察细胞克隆形成能力的改变;Real-time PCR技术检测细胞中生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6,以及肿瘤细胞转移相关分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表达变化;最后,利用Western blot检测相关信号途径,包括Akt/m TOR、Erk等途径的传递改变。随后,将p-mi R-21-ASOs载体(4μg)和si-LEMD3干扰序列(50 n M)共转染入人肺癌95D细胞中;CCK-8法和Scratch assay法观察人肺癌95D细胞体外增殖和迁移的影响;克隆形成实验观察95D细胞克隆形成能力的改变;Real-time PCR检测细胞中生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达变化以及转移相关分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4等的表达变化;最后,利用Western blot技术检测LEMD3蛋白、磷酸化Akt、磷酸化Erk以及总Akt、Erk蛋白的表达水平。结果:第一部分经鉴定成功构建mi RNA-21过表达载体p-mi R-21;与p-Cont对照组相比,p-mi R-21-ASOs转染组中mi R-21的表达显著下调(P0.05),而p-mi R-21转染组中的表达显著上调(P0.05);且p-mi R-21-ASOs转染组肿瘤细胞数随着剂量的增加逐渐减少(P0.05),而p-mi R-21转染组中肿瘤细胞数随着剂量的增加逐渐增多(P0.05);与p-Cont组相比,p-mi R-21-ASOs转染组95D细胞的增殖和迁移能力均明显降低(P0.05),而p-mi R-21转染组中95D细胞则明显增强(P0.05);与p-Cont对照组相比,p-mi R-21-ASOs转染组细胞的侵袭和迁移数减少,而p-mi R-21转染组细胞的则增多(P0.05);与p-Cont对照组相比,p-mi R-21-ASOs转染组中95D细胞生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达均显著下调(P0.05),而p-mi R-21转染组中的表达均显著上调(P0.05),此外,p-mi R-21-ASOs转染组中肿瘤细胞转移相关分子E-cadherin的表达上调,MMP-2、MMP-9和CXCR4的表达均下调(P0.05),而p-mi R-21转染组中E-cadherin的表达下调,MMP-2、MMP-9和CXCR4的表达均显著上调(P0.05);p-mi R-21-ASOs转染组中95D细胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均明显下调(P0.05),而p-mi R-21转染组细胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均明显上调(P0.05)。第二部分初步筛选出mi R-21的候选10个靶分子,p-mi R-21-ASOs转染组95D细胞中抑癌靶基因SOCS6、HBP1、PTEN、PDCD4、RECK、SPRY1、TIMP3明显上调(P0.05),促癌靶基因TIAM1、PIK3R1、HIF1α明显下调的(P0.05);与之相反,p-mi R-21转染组中的这些抑癌靶基因是下调的(P0.05),而促癌靶基因均明显上调(P0.05);结合相关文献报道,筛选出mi R-21可能的新候选靶分子LEMD3;与p-Cont组相比,p-mi R-21-ASOs转染组LEMD3的表达均表达上调(P0.05);而p-mi R-21转染组LEMD3的表达均表达下调(P0.05),提示LEMD3为mi R-21的新靶分子。si-LEMD3转染组中的LEMD3 m RNA水平和蛋白表达均表达下调(P0.05),且细胞数较Control组明显增加;与Control组相比,si-LEMD3转染组95D细胞的增殖和迁移能力均明显增强(P0.05),且肿瘤细胞克隆形成能力明显增加(P0.05);与Control对照组相比,si-LEMD3转染组中95D细胞生长周期相关的周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达均显著上调(P0.05),而肿瘤细胞转移相关分子除E-cadherin的m RNA下调外,其余三个MMP-2、MMP-9和CXCR4的m RNA均表达上调(P0.05);与Control对照组相比,si-LEMD3转染组95D细胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均明显上调(P0.05)。与p-mi R-21-ASOs+si-control对照组相比,p-mi R-21-ASOs和si-LEMD3共转染组95D细胞中LEMD3蛋白表达均明显减少(P0.05);且细胞数显著增多;与p-mi R-21-ASOs+si-control对照组相比,p-mi R-21-ASOs+si-LEMD3转染组95D细胞的增殖和迁移能力均显著增强(P0.05),同时肿瘤细胞克隆形成能力明显增加(P0.05);与p-mi R-21-ASOs+si-cont对照组相比,p-mi R-21-ASOs+si-cont转染组中95D细胞CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达均显著上调,差异具有统计学意义(P0.05),肿瘤细胞转移相关分子除E-cadherin的m RNA均表达下调,其余三个MMP-2、MMP-9和CXCR4的m RNA均表达上调(P0.05);与p-mi R-21-ASOs+si-control对照组相比,p-mi R-21-ASOs+si-LEMD3转染组95D细胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表达均明显上调,且具有统计学意义(P0.05)。结论:第一部分:改变mi R-21的表达可显著影响人肺癌细胞的体外生长和迁移,提示mi R-21可能是人肺癌基因治疗的潜在新靶标之一。第二部分:mi R-21调控人肺癌细胞体外生长与迁移的效应与其靶分子LEMD3表达改变有关,涉及Akt、Erk等相关信号途径传递的变化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2
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本文编号：
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