B7-H3在人食管癌中的表达及其与肿瘤相关巨噬细胞相互作用的机制研究

发布时间：2019-04-26 21:05

【摘要】：目的:食管癌是发生在食管粘膜上皮的恶性肿瘤,是世界第七大恶性肿瘤。我国是世界上食管癌发生率和重中之重重中之重病死率最高的国家之一,严重困扰着国民的身心健康,所以,寻找食管癌的特异性生物标记物,用于早期诊断和靶向治疗成为研究食管癌的热点。肿瘤免疫疗法是继手术、放化疗后第四大有效的抗肿瘤疗法,免疫疗法基于肿瘤特异性抗原和免疫细胞。近年来,共刺激分子B7-H3作为B7免疫球蛋白超家族的新成员,在多种肿瘤组织异常高表达,并与肿瘤的生物学特性密切相关,被认为可能是一种新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点。肿瘤微环境中大量存在的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)在肿瘤的发生、生长、侵袭和转移过程中扮演着十分重要的角色。肿瘤特定微环境迫使巨噬细胞表型向着有利于肿瘤发展的方向演变,即M2型TAM,其在肿瘤进展和转移过程中的重要作用,已成为抗肿瘤治疗的新热点。本课题旨在通过检测食管癌组织及对应癌旁组织中B7-H3、CD68和CD163蛋白的表达,分析B7-H3表达、M2型TAM浸润与食管癌临床病理资料的相关性。检测不同食管癌细胞株Eca-109、TE-1、TE-13、KYSE-170细胞中B7-H3的表达水平,并通过靶向干扰B7-H3基因表达来研究Eca-109细胞对巨噬细胞极化的影响。方法:1用实时荧光定量PCR(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,Real-time PCR)方法检测HLA-DRa和CD163 m RNA在食管癌组织和对应癌旁组织中的表达水平;2用免疫组织化学方法检测B7-H3、CD68和CD163蛋白在食管癌组织中的表达水平,并分析其表达与临床病理特征及预后的关系;3用Real-time PCR和Western blot方法检测食管癌细胞株Eca-109、TE-1、TE-13、KYSE-170中B7-H3 m RNA和蛋白表达情况;4用Real-time PCR和Western blot方法检测上调和下调B7-H3基因后,Eca-109细胞中B7-H3 m RNA和蛋白表达情况;5用Real-time PCR方法检测上调和下调B7-H3基因的Eca-109细胞与巨噬细胞共培养后,巨噬细胞中HLA-DRa和CD163 m RNA表达情况;6用流式细胞分析技术(flow cytometry,FCM)检测上调和下调B7-H3基因的Eca-109细胞与巨噬细胞共培养后,巨噬细胞表面HLA-DR、CD86、CD163和CD206蛋白的表达情况;7用ELISA方法检测上调和下调B7-H3基因后,Eca-109细胞培养上清中IL-6和M-CSF的分泌量;8用Western blot方法检测上调和下调B7-H3基因的Eca-109细胞与巨噬细胞共培养后,巨噬细胞表面P-STAT3、STAT3和P-P65、P65蛋白表达情况;9用Real-time PCR方法检测巨噬细胞中分别加入STAT3通路抑制剂AG490和NF-κB通路抑制剂PDTC后,再分别与上调和下调B7-H3基因的Eca-109细胞共培养,巨噬细胞中HLA-DRa和CD163 m RNA表达情况;10用FCM检测巨噬细胞中分别加入STAT3通路抑制剂AG490和NF-κB通路抑制剂PDTC后,再分别与上调和下调B7-H3基因的Eca-109细胞共培养,巨噬细胞表面HLA-DR、CD86、CD163和CD206蛋白的表达情况。结果:1 Real-time PCR检测结果显示,30例食管癌组织中HLA-DRa(2.128±0.127)和CD163(5.696±0.136)m RNA的表达水平显著高于对应癌旁组织(1.000±0.000),差异具有显著性意义(P0.01),食管癌组织中CD163 m RNA的表达水平显著高于HLA-DRa,差异具有显著性意义(P0.001)。2免疫组织化学分析结果显示,70例食管癌组织中,B7-H3蛋白主要定位在肿瘤细胞胞质和胞膜,阳性表达率为98.6%(69/70),明显高于对应癌旁组织的7.1%(5/70),χ2=117.41,P0.001;CD68和CD163蛋白大部分聚集在癌间质巨噬细胞的胞质和胞膜,呈灶状或片状分布。CD68阳性表达率为91.4%(64/70),明显高于对应癌旁组织的18.6%(13/70),χ2=75.07,P0.001;而CD163阳性表达率为84.3%(59/70),对应癌旁组织中几乎不表达。B7-H3表达与患者肿瘤浸润深度相关,差异具有统计学意义(P0.05)。CD68表达与患者肿瘤浸润深度相关,差异具有统计学意义(P0.05)。CD163表达与患者肿瘤大小及肿瘤浸润深度相关,差异具有统计学意义(P0.05)。3 Spearman相关性分析显示,70例食管癌组织中B7-H3蛋白表达水平与CD68表达呈正相关(R=0.300,P0.05),与CD163表达也呈正相关(R=0.288,P0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,食管癌组织中B7-H3、CD68和CD163蛋白呈高表达者总体生存率明显低于低表达者,差异具有统计学意义(P0.05)。4 Real-time PCR检测结果显示,B7-H3 m RNA在食管癌Eca-109(0.449±0.037)、TE-1(0.488±0.027)、TE-13(1.000±0.000)和KYSE-170(0.297±0.016)细胞中均表达,在TE-13中的表达量最高。Western blot结果显示,B7-H3蛋白在TE-1(0.865±0.023)中呈中表达,在KYSE-170(0.443±0.018)中呈低表达,而在Eca-109(1.129±0.010)和TE-13(1.146±0.017)中呈高表达,且两者间的表达量差异无统计学意义(P0.05)。5 Real-time PCR检测结果显示,Eca-109/B7-H3中B7-H3 m RNA表达水平明显高于Eca-109/control[(1.624±0.055)vs(0.932±0.037),P0.01]及Eca-109组[(1.624±0.055)vs(1.000±0.000),P0.01];Eca-109/B7-H3 si RNA中B7-H3 m RNA表达水平明显低于Eca-109/control si RNA[(0.295±0.067)vs(0.929±0.037),P0.01]及Eca-109组[(0.295±0.067)vs(1.000±0.000),P0.01]。Western blot检测结果显示,Eca-109/B7-H3中B7-H3蛋白表达水平明显高于Eca-109/control[(0.164±0.007)vs(0.092±0.002),P0.001]及Eca-109组[(0.164±0.007)vs(0.091±0.001),P0.001],Eca-109/B7-H3 si RNA中B7-H3蛋白表达水平明显低于Eca-109/control si RNA[(0.028±0.001)vs(0.091±0.001),P0.001]及Eca-109组[(0.028±0.001)vs(0.091±0.001),P0.001]。6 Real-time PCR检测结果显示,与单独培养巨噬细胞相比,Eca-109细胞与巨噬细胞共培养48h后,巨噬细胞中CD163 m RNA表达增加[(1.645±0.062)vs(1.000±0.000),P0.001],HLA-DRa m RNA表达降低[(0.865±0.065)vs(1.000±0.000),P0.05],说明Eca-109细胞与巨噬细胞共培养后诱导巨噬细胞向M2型极化。Eca-109/B7-H3与巨噬细胞共培养48h后,巨噬细胞中CD163 m RNA表达水平明显高于正常共培养体系[(2.606±0.128)vs(1.645±0.062),P0.001],HLA-DRa m RNA表达水平明显低于正常共培养体系[(0.537±0.083)vs(0.865±0.065),P0.01],说明Eca-109/B7-H3能够促使巨噬细胞向M2型极化。而Eca-109/B7-H3 si RNA与巨噬细胞共培养48h后,巨噬细胞中HLA-DRa m RNA表达水平明显高于正常共培养体系[(1.753±0.073)vs(0.865±0.065),P0.001],CD163 m RNA表达水平明显低于正常共培养体系[(0.544±0.049)vs(1.645±0.062),P0.001],说明Eca-109/B7-H3si RNA能够逆转巨噬细胞向M1型极化。7 FCM检测结果显示,与单独培养巨噬细胞相比,Eca-109细胞与巨噬细胞共培养48h后,巨噬细胞表面CD163[(36.400±1.353)vs(23.367±1.201),P0.001]和CD206[(26.367±1.210)vs(23.733±0.971),P0.05]蛋白表达增加,HLA-DR[(20.333±0.833)vs(23.400±0.755),P0.01]和CD86[(18.500±0.557)vs(21.633±0.833),P0.01]蛋白表达降低,说明Eca-109细胞与巨噬细胞共培养后诱导巨噬细胞向M2型极化。Eca-109/B7-H3与巨噬细胞共培养48h后,巨噬细胞表面CD163[(630.333±1.528)vs(36.400±1.353),P0.001]和CD206[(36.200±1.114)vs(26.367±1.210),P0.001]蛋白表达水平明显高于正常共培养体系,HLA-DR[(11.167±0.850)vs(20.333±0.833),P0.001]和CD86[(10.867±0.611)vs(18.500±0.557),P0.001]蛋白表达水平明显低于正常共培养体系,说明Eca-109/B7-H3能够促使巨噬细胞向M2型极化。而Eca-109/B7-H3 si RNA与巨噬细胞共培养48h后,巨噬细胞表面HLA-DR[(241.667±1.528)vs(20.333±0.833),P0.001]和CD86[(64.567±0.850)vs(18.500±0.557),P0.001]蛋白表达水平明显高于正常共培养体系,CD163[(17.467±0.907)vs(36.400±1.353),P0.01]和CD206[(13.533±1.069)vs(26.367±1.210),P0.001]蛋白表达水平明显低于正常共培养体系,说明Eca-109/B7-H3 si RNA能够逆转巨噬细胞向M1型极化。8 ELISA检测结果显示,Eca-109/B7-H3培养上清中IL-6[(38.713±1.991pg/ml)vs(26.267±1.560 pg/ml),P0.01]和M-CSF[(85.380±6.052 pg/ml)vs(59.600±4.733 pg/ml),P0.01]的分泌量明显高于Eca-109细胞分泌量,差异具有统计学意义;而Eca-109/B7-H3 si RNA培养上清中IL-6[(15.033±1.427 pg/ml)vs(26.267±1.560 pg/ml),P0.001]和M-CSF[(28.367±4.747 pg/ml)vs(59.600±4.733 pg/ml),P0.01]的分泌量明显低于Eca-109细胞分泌量。9 Western blot检测结果显示,Eca-109/B7-H3与巨噬细胞共培养48h后,巨噬细胞表面P-STAT3[(0.219±0.010)vs(0.097±0.008),P0.001]和STAT3[(1.539±0.026)vs(1.876±0.012),P0.001]蛋白表达水平明显高于正常共培养体系;而Eca-109/B7-H3 si RNA与巨噬细胞共培养48h后,巨噬细胞表面P-P65[(0.257±0.007)vs(0.173±0.002),P0.001]和P65[(0.347±0.007)vs(0.292±0.009),P0.01]蛋白表达水平明显高于正常共培养体系。10 Real-time PCR检测结果显示,巨噬细胞中加入STAT3信号通路抑制剂AG490后与Eca-109/B7-H3共培养48h,巨噬细胞中CD163 m RNA表达水平明显低于未加抑制剂组[(1.918±0.088)vs(2.606±0.128),P0.01],HLA-DRa m RNA表达水平略高于未加抑制剂组[(0.624±0.079)vs(0.537±0.083),P0.05],说明巨噬细胞中加入STAT3通路抑制剂AG490后,能抑制Eca-109/B7-H3促使巨噬细胞M2型极化的作用。而巨噬细胞中加入NF-κB通路抑制剂PDTC后与Eca-109/B7-H3 si RNA共培养48h,巨噬细胞中HLA-DRa m RNA表达水平明显低于未加抑制剂组[(1.310±0.056)vs(1.753±0.073),P0.01],CD163 m RNA表达水平明显高于未加抑制剂组[(1.185±0.134)vs(0.544±0.049),P0.01],说明巨噬细胞中加入NF-κB通路抑制剂PDTC后,能抑制Eca-109/B7-H3si RNA促使巨噬细胞M1型极化的作用。11 FCM检测结果显示,巨噬细胞中加入STAT3信号通路抑制剂AG490后与Eca-109/B7-H3共培养48h,巨噬细胞表面CD163[(70.367±0.862)vs(159.333±2.517),P0.001]和CD206[(60.967±1.301)vs(149.667±2.082),P0.001]蛋白表达水平明显低于未加抑制剂组,HLA-DR[(60.433±1.026)vs(29.500±0.985),P0.001]和CD86[(24.767±0.551)vs(11.867±0.651),P0.001]蛋白表达水平明显高于未加抑制剂组,说明巨噬细胞中加入STAT3通路抑制剂AG490后,能抑制Eca-109/B7-H3促使巨噬细胞M2型极化的作用。而巨噬细胞中加入NF-κB通路抑制剂PDTC后与Eca-109/B7-H3 si RNA共培养48h,巨噬细胞表面HLA-DR[(140.333±1.528)vs(238.667±3.512),P0.001]和CD86[(30.567±0.709)vs(49.433±0.709),P0.001]蛋白表达水平明显低于未加抑制剂组,CD163[(31.700±0.755)vs(12.700±0.819),P0.001]和CD206[(25.500±0.656)vs(13.100±0.557),P0.001]蛋白表达水平明显高于未加抑制剂组,说明巨噬细胞中加入NF-κB通路抑制剂PDTC后,能抑制Eca-109/B7-H3 si RNA促使巨噬细胞M1型极化的作用。结论:1共刺激分子B7-H3和M2型TAM标记物CD68、CD163蛋白在人食管癌组织中高表达,且与食管癌患者的进展及预后密切相关,有望成为监测食管癌进展的重要指标。2靶向干扰B7-H3基因在体外能逆转巨噬细胞的M2型极化,提示B7-H3基因可能参与调节食管癌肿瘤微环境中的免疫细胞,为免疫治疗提供潜在的治疗靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1

【参考文献】