ASPP2及HIV蛋白酶抑制剂对结直肠癌细胞自噬及凋亡的影响

发布时间：2019-05-07 13:24

【摘要】：背景结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)作为威胁人类健康的恶性肿瘤之一,具有极高的发病率和致死率。肿瘤抑制基因P53的突变或失活是引起结直肠癌的重要诱因。P53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)能够与P53结合,选择性增强P53的促细胞凋亡活性。HIV蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitors,PIs)是用于治疗HIV感染的化疗药物,其药理机制是抑制天冬酰胺蛋白酶前体的裂解活化,进而抑制HIV病毒颗粒的成熟。近期研究发现HIV PIs有着广泛的抗肿瘤作用。体外方面,已有多篇文章报道HIV PIs对乳腺癌、非小细胞型肺癌、肝细胞癌和卡波西肉瘤等有抗肿瘤作用。体内方面,有人用裸鼠试验证明HIV PIs能够有效地抑制肺癌、乳腺癌和肝癌肿瘤生长。而有关HIV PIs对结直肠癌的影响鲜有报道。目的本实验拟在以往研究的基础上,结直肠癌细胞在不同P53表达水平时,研究HIV PIs对其自噬、凋亡的影响,结直肠癌细胞在相同P53表达水平时,研究HIV PIs与奥沙利铂相比,两者对结直肠癌细胞凋亡和自噬水平的影响,以及在ASPP2不同表达水平时,HIV蛋白酶抑制剂对结直肠癌细胞自噬及凋亡的影响。为进一步深入研究HIV PIs单独或联合奥沙利铂等结直肠癌化疗对结直肠癌治疗提供可靠依据。方法第一部分实验:1.慢病毒转染除HCT116+/+(P53野生型)中P53基因得到稳转表达的P53却失型细胞(HCT116+/+-sh P53)及ASPP2却失型细胞(HCT116+/+-sh ASPP2)以及对照细胞(HCT116+/+-sh Ctrl);2.MTT法检测不同时间点(12小时、24小时及36小时)三种HIV蛋白酶抑制剂(利托那韦、洛匹那韦、地瑞那韦)分别对HCT116+/+-sh Ctr(p53野生型)细胞生长抑制的影响;以及药物作用24小时后分别对HCT16+/+-sh Ctrl/HCT116+/+-sh P53细胞生长抑制的影响第二部分实验:1.分别用地瑞那韦和奥沙利铂对HCT116+/+-sh Ctrl细胞的半数抑制浓度处理HCT116+/+-sh Ctrl细胞,24小时后,利用Western-blot分析自噬蛋白LC3及凋亡蛋白Casepase-3水平变化及Calcein-AM/PI法检测细胞凋亡情况;2.为检测不同ASPP2表达水平上,HIV蛋白酶抑制剂地瑞那韦对大肠癌细胞自噬凋亡的影响,本实验分组为GFP组、ASPP2组、sh ASPP2组、GFP+DRV组、ASPP2+DRV组、sh ASPP2+DRV组共6组;3.为检测药物对细胞周期的影响及不同ASPP2表达水平时地瑞那韦对细胞周期的影响,本实验分组为对照组、GFP组、ASPP2组、ASPP2+DRV组、GFP+DRV组、DRV组。结果第一部分:1.经慢病毒敲除P53及ASPP2基因,得到能够稳定转染细胞系,结果由WB验证;2..蛋白酶抑制剂地瑞那韦可以诱导HCT116+/+-sh Ctrl细胞凋亡,而且凋亡比例随着药物浓度的升高而增强;3.本次实验采用MTT法检测12h/24h/36h三个不同时间点,三种蛋白酶抑制剂RTV、LPV、DRV对HCT116+/+细胞生长抑制的影响;在三个不同时间点中,药物作用24h时所获得的曲线相对更为稳,因此选取24h为最佳作用时间。选取药物作用24h,检测三种蛋白酶抑制剂分别对HCT116+/+-sh Ctrl及HCT116+/+sh P53细胞生长抑制的影响。得出三种蛋白酶抑制剂诱导HCT116+/+sh Ctr细胞半数抑制浓度(IC50)分别为利托那韦IC50约为25μg/ml、洛匹那韦IC50约为25μg/ml、地瑞那韦约为40μg/ml;诱导HCT116+/+sh P53细胞半数抑制浓度(IC50)分别为利托那韦约为20μg/ml、洛匹那韦约为18μg/ml、地瑞那韦约为30μg/ml。我们发现与HCT116+/+-sh Ctr相比,HCT116+/+-sh P53对HIV PIs化疗更敏感。第二部分:1.与奥沙利铂相比,蛋白酶抑制剂地瑞那韦也能诱导细胞自噬凋亡;2.利用Calcein-AM/PI染色法检测各组细胞凋亡情况,各组细胞凋亡率分别为(1.85±0.53)%、(4.57±0.75)%、(1.95±0.44)%、(39.5±4.29)%、(47.7±6.20)%、(32.68±2.49)%,GFP组与ASPP2组相比(P0.01)具有统计学意义,GFP+DRV组与ASPP2+DRV组相比(P=0.0360.05)具有统计学意义;ASPP2+DRV组与sh ASPP2+DRV组相比(P0.01)具有统计学意义;利用WB检测细胞自噬、凋亡蛋白表达水平。我们发现ASPP2过表达可增强HCT116-P53+/+细胞对地瑞那韦的敏感性;ASPP2低表达可以促进HCT116-P53+/+细胞自噬,降低其对地瑞那韦的敏感性;3.检测细胞周期我们发现各组细胞的增殖指数分别为(48.72±2.06)%、(45.00±5.64)%、(40.25±3.96)%、(18.55±1.38)%、(26.70±1.07)%、(28.56±2.53)%,在组间两两比较中,除正常培养组与GFP组(P=0.2890.05)以及地瑞那韦组与奥沙利铂组(P=0.482,0.05)差异无统计学意义之外,其余组间两两比较P0.05,差异有统计学意义。结论1.与HCT116+/+-sh Ctrl相比,HCT116+/+-sh P53对HIV PIs化疗效果更敏感。2.HIV蛋白酶抑制剂具有诱导细胞自噬凋亡能力,但与奥沙利铂对照组相比,其诱导细胞自噬凋亡能力与奥沙利铂相当。3.ASPP2过表达可以抑制HCT116细胞自噬,提高其对HIV蛋白酶抑制剂地瑞那韦的敏感性;相反,抑制ASPP2表达促进细胞自噬,降低其对地瑞那韦的敏感性。4.地瑞那韦能通过引起G0/G1期阻滞抑制肿瘤细胞增殖,同时,ASPP2能协同增强其抑制肿瘤细胞增殖效果。
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【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

【参考文献】