Toll样受体2与肝癌发生机制研究

发布时间：2019-05-10 20:00

【摘要】：肝癌是一种死亡率较高、严重威胁人类健康的重大疾病之一。慢性病毒感染、代谢异常以及毒性摄入等都是肝癌发生的重要原因。肝癌的发生除了与肝实质细胞本身的基因突变有关之外,与所处的免疫微环境关系密切,包括肿瘤局部的细胞因子、趋化因子等蛋白的表达变化,抑制性免疫细胞(包括调节性T细胞,M2型巨噬细胞或是髓系来源的抑制性细胞)的浸润和抗肿瘤细胞(NK细胞,CD8+T细胞)的耗竭等诸多方面。抑制性细胞因子IL-10, TGF-β等上调表达以及免疫抑制细胞的聚集是肿瘤发生时普遍存在的现象,也成为肿瘤免疫治疗的关键干预靶点。 Toll样家族分子在肿瘤进程中的作用已经多有报道,不同的TLR分子可能发挥不同的作用,探明不同的TLR分子在肿瘤发生中的作用对肿瘤治疗具有重要意义。TLR7, TLR8, TLR9激动剂可以用于治疗小鼠肿瘤,已经进入临床研究阶段。本研究中我们首次证明TLR2激动剂可以用于肝癌的治疗。我们首先采用流式细胞术检测了化学药物诱发的肝癌中肝细胞上TLR2分子的表达；之后采用TLR2缺陷小鼠,通过组织染色、免疫组化以及荧光定量PCR等方法检测了TLR2在肝癌发生发展中的表达动力学；接着我们通过肿瘤判定,流式分析细胞亚群变化,免疫印迹等方法发现caspase-8-IL-18-MDSC轴的过度活化是TLR2缺陷鼠易感肿瘤的原因；同时采用IL-18过表达质粒注射、IL-18沉默、caspase-8干扰等技术,证明TLR2对caspase-8-IL-18轴的负调效应：最后激动剂活化TLR2,实现了对肝癌小鼠的免疫治疗。基于以上研究思路以及实验方法,我们取得了以下实验结果： 1.肝癌发生过程中TLR2分子表达下调和TLR2活化能够抑制肿瘤生长本研究建立小鼠自发肝癌模型来研究TLR2分子在肝癌发生中的作用。在化学药物二乙基亚硝胺诱导8个月后所有小鼠均发生肝癌。通过流式细胞术以及蛋白质免疫印迹等方法,我们发现肝细胞上TLR2分子表达下调。同时我们采用TLR2激动剂Pam3CSK4进行DEN肿瘤模型小鼠TLR2信号的长期活化,发现TLR2分子活化后能够减缓肝癌的发生。这些研究结果说明TLR2分子可能在肝癌发生中发挥作用。 2.TLR2缺陷鼠易感自发性肝癌此后,我们引入TLR2缺陷小鼠进行DEN肿瘤模型的诱导。TLR2缺陷小鼠在诱导8个月以后能够发生更加严重的肿瘤。组织病理学分析能够看到更大的肿瘤区域,并且肝细胞表现更强的细胞增殖能力(PCNA+)。同时通过荧光定量PCR的方法能够检测到更多肿瘤指标甲胎蛋白(AFP)的表达,说明TLR2分子在小鼠自发肝癌中起保护作用。 3.TLR2缺陷鼠中免疫细胞处于耗竭状态我们同时检测了肿瘤小鼠中免疫细胞的状态。尽管T细胞在DEN诱导的肝癌模型中的作用在免疫缺陷鼠(Rag14-)中已得到确认,但是在TLR2缺陷鼠中所处状态还不清楚。我们发现,DEN处理后TLR2缺陷鼠肝脏以及脾脏CD8+T细胞高表达PD-1,同时产生TNF-a以及穿孔素的能力降低。这些结果说明TLR2缺陷鼠在DEN诱导后免疫细胞处于耗竭状态。 4.TLR2缺陷小鼠经DEN诱导以后表达更多的髓系来源抑制样细胞小鼠经DEN诱导之后,单核样MDSC (CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chigh)在TLR2缺陷小鼠各脏器中均表达升高。对单核样MDSC进行时间动力学监测,发现在DEN诱导5月以后TLR2缺陷小鼠肝脏中MDSC明显多于野生鼠。同时,TLR2缺陷鼠的肝脏中表达较高水平的iNOS,并且阻断其表达后能够恢复T细胞功能。此外,我们对来源于野生鼠以及TLR2缺陷小鼠的MDSC的功能进行了比较,发现两者抑制T细胞增殖以及产生IFN-y的能力没有区别,并且两者活化表型相似。只有TLR2缺陷鼠的MDSC表达较高水平的ki-67,这些实验结果说明来源于TLR2缺陷鼠的单核样MDSC是通过增加MDSC的数量,进而产生大量的iNOS来发挥抑制T细胞功能的。 5.来源于肝细胞的IL-18能够诱导髓系来源的抑制样细胞产生接下来,我们就对MDSC增多的机制进行了探索。首先,通过荧光定量PCR的方法,我们对多种细胞因子进行了检测。结果发现只有IL-18的]mRNA在TLR2缺陷鼠中是上调表达的。并且通过免疫组化以及蛋白质免疫印迹实验可以看到IL-18主要是由肝实质细胞产生的。在TLR2缺陷鼠中观察到IL-18与MDSC表达的正相关性,提示我们IL-18可能具有诱导MDSC的作用。为了验证这一猜测,我们首先检测了MDSC上IL-18受体的表达,发现DEN处理后单核样MDSC上确实表达较高水平的IL-18受体。同时我们通过体外培养以及体内IL-18过表达实验也证实了IL-18能够诱导MDSC产生。 6.肝细胞特异性干扰IL-18能够降低髓系来源的抑制样细胞的聚集并减缓肿瘤的发生我们进行了体内干扰实验验证IL-18对MDSC以及肿瘤发生的影响。当在肿瘤发生过程中使用高压注射的方式干扰掉肝细胞中IL-18的表达以后,尽管在野生鼠中没有看到肿瘤发生程度的区别,干扰IL-18的表达能够明显减轻TLR2缺陷小鼠的肿瘤发生程度,同时单核样MDSC的细胞比例明显下调,CD8’T细胞功能得到恢复。 7.TLR2缺陷鼠中IL-18的产生依赖于caspase-8 我们对TLR2分子调控IL-18的机制进行了探究。在DEN处理后,TLR2缺陷小鼠肝脏中表达更高水平的caspase-8,而当使用Pam3CSK4进行活化后caspase-8的表达降低,这就提示我们caspase-8可能与IL-18的产生有关。因此,我们构建了caspase-8的干扰质粒对肝细胞进行特异性干扰,结果发现在TLR2缺陷鼠中干扰caspase-8以后,血清ALT以及IL-18的表达水平明显降低,说明TLR2分子调控IL-18的表达是通过caspase-8来完成的。 8.TLR2激动剂Pam3CSK4处理能够降低髓系来源的抑制样细胞聚集并且恢复抗肿瘤免疫应答根据之前的研究结果,我们发现TLR2激动剂能够减缓肿瘤的发生。在本部分研究中,我们发现Pam3CSK4处理后能够同时降低单核样以及粒细胞样MDSC的比例以及细胞绝对数。血清中IL-18的表达水平在TLR2活化后明显降低。此外,我们发现TLR2激动剂处理后能够明显上调活化的CD8+T细胞的比例以及绝对数。同时,在抗肿瘤免疫中起重要作用的细胞因子的表达得到明显恢复。这些结果说明TLR2激动剂能够通过抑制IL-18-MDSC-CTL轴来减缓肿瘤的发生。结论：我们的研究揭示了在肝癌发病过程中TLR2分子扮演的重要角色。TLR2分子缺失能够加剧IL-18介导的免疫抑制,而TLR2活化则能够逆转这一机制并最终减缓肿瘤的发生。这一研究成果为肝癌的免疫治疗提供了新的思路。
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【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

【参考文献】