【摘要】：目的:本课题组前期相关研究证实,在体内外二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)均能呈剂量依赖性发挥调控作用,抑制人白血病HL-60细胞增殖迁移侵袭和诱导分化。最新的相关蛋白组学研究发现,DADS可在多种肿瘤细胞中调控RhoGDI2蛋白低表达。本研究依据课题组前期相关研究取得的结论,通过构建RhoGDI2高表达的人白血病HL-60细胞系,探讨DADS对RhoGDI2高表达HL-60细胞分化的影响。方法:将pIRES2-EGFP-RhoGDI2真核表达载体转染人白血病HL-60细胞,构建RhoGDI2稳定高表达HL-60细胞系。运用CCK-8试验、细胞迁移实验、Transwell侵袭实验、流式细胞术、NBT及免疫荧光试验观察DADS对RhoGDI2高表达HL-60细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期及分化等生物学行为的影响。Western blot检测DADS对RhoGDI2高表达HL-60细胞Rac1/Pak1/LIMK1信号通路调控相关蛋白的表达情况。结果:1.成功构建RhoGDI2稳定高表达的HL-60细胞系。将经过G418筛选2周培养获得的高表达组与阴性转染组细胞在免疫荧光显微镜下观察均可见大量的绿色荧光。提取高表达组、阴性转染组和未转染组的细胞蛋白,经Western blot试验检测及QT-PCR,结果显示:实验组(RhoGDI2/HL-60)细胞中RhoGDI2蛋白表达及m RNA明显增高(P0.05),且高于阴性转染组和未转染组中的表达,提示成功获得RhoGDI2稳定高表达的HL-60细胞系。将上述高表达组与阴性转染组细胞送公司测序,测序结果显示,高表达组细胞中的质粒p IRES2-EGFP-RhoGDI2的插入序列与RhoGDI2基因全长c DNA的Gen Bank序列完全一致。证实成功获得RhoGDI2稳定高表达的HL-60细胞系。2.DADS对RhoGDI2稳定高表达HL-60细胞生物学行为的影响2.1 DADS对RhoGDI2稳定高表达HL-60细胞增殖的影响CCK-8结果显示,DADS处理24小时后,高表达组、阴性转染组和未转染组细胞的增殖能力较未处理前相比均明显减弱,并且DADS对阴性转染组和未转染组的细胞增殖抑制效果较高表达组更显著(P0.05)。同时发现经DADS处理和经ATRA处理相关细胞处理组之间无统计学意义(P0.05)。提示RhoGDI2蛋白稳定高表达可降低DADS对HL-60细胞的增殖抑制作用。2.2 DADS对RhoGDI2高表达HL-60细胞迁移侵袭的影响Transwell迁移实验结果显示,DADS未处理前,高表达组细胞迁移数(率)明显高于阴性转染组和未转染组(P0.05);而经DADS处理24h后,高表达组、阴性转染组和未转染组三组细胞的迁移能力均较未处理前明显降低(P0.05),而DADS处理和ATRA处理相关细胞处理组之间无统计学意义(P0.05)。提示RhoGDI2高表达可降低DADS对HL-60细胞的迁移抑制作用。Transwell侵袭实验结果显示:DADS未处理前,高表达组细胞的穿膜数较阴性转染组和未转染组明显增多(P0.05);DADS处理24h后,高表达组、阴性转染组和未转染组细胞的细胞较未处理组穿膜数较未处理前明显降低(P0.05);而DADS处理和ATRA处理各组之间无统计学意义(P0.05)。提示RhoGDI2高表达可降低DADS对HL-60细胞的侵袭抑制作用。2.3 DADS对RhoGDI2高表达HL-60细胞分化的影响NBT实验结果显示,DADS未处理前,阴性转染组和未转染组细胞还原率明显高于高表达组(P0.05);而DADS处理24h后,高表达组、阴性转染组和未转染组三组细胞对硝基蓝四唑的还原能力均较未处理明显增强(P0.05);DADS处理和ATRA处理相关各组之间无统计学意义(P0.05)。提示RhoGDI2高表达可降低DADS对HL-60细胞的诱导分化作用。细胞免疫荧光实验结果显示,DADS未处理前,高表达组、阴性转染组和未转染组细胞表面的CD11b均呈弱表达,高表达组CD33表达量明显高于阴性转染组和未转染组;而经DADS处理24h后,三组细胞表面的CD11b表达均较未处理时明显增加,三组细胞表面的CD33表达均较未处理时明显降低,且高表达组细胞表面CD33降低幅度较阴性转染组和未转染组少;DADS处理和ATRA处理相关各组之间无统计学意义(P0.05)。提示RhoGDI2高表达可降低DADS对HL-60细胞的诱导分化作用。2.4 DADS对RhoGDI2高表达HL-60细胞周期的影响流式细胞术结果显示,DADS未处理前,高表达组细胞的S期/G1期细胞比率明显高于阴性转染组和未转染组(P0.05),提示RhoGDI2高表达可增强HL-60细胞的增殖作用。而经DADS处理24h后,高表达组、阴性转染组和未转染组三组细胞G1期细胞百分率均较未处理时明显提高(P0.05),S期细胞百分率均明显降低(P0.05),表明DADS处理后出现G1期细胞阻滞。3.DADS对RhoGDI2高表达HL-60细胞对Rac1/Pak1/LIMK1通路的影响Western blot结果显示,RhoGDI2高表达可上调HL-60细胞Rac1、Pak1及LIMK1表达(P0.05)。DADS处理24h后,高表达组、阴性转染组和未转染组细胞RhoGDI2、Rac1、Pak1及LIMK1等蛋白的表达水平均较未处理时显著下调(P0.05)。提示DADS可下调RhoGDI2调控Rac1/Pak1/LIMK1通路。结论:1.DADS可下调RhoGDI2调控Rac1/Pak1/LIMK1通路诱导HL-60细胞分化。2.RhoGDI2高表达可增强HL-60细胞增殖与迁移侵袭和抑制分化。3.RhoGDI2高表达可削弱DADS对HL-60细胞诱导分化作用。
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【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7
【参考文献】
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2474144
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