MicroRNA-1在食管鳞状细胞癌中的表达和调控作用及其潜在诊断价值研究

发布时间：2019-05-18 05:23

【摘要】：食管癌是世界上常见的第八大恶性肿瘤,目前中国食管癌发病率为19.34/10万,在癌症新发病例构成中位居第6位,占全部癌症发病的7.27%。食管癌死亡率为15.39/10万,占全部癌症死亡总数的8.96%,在癌症死亡原因中列第4位。根据食管癌的组织学特点可分为五种类型,其中食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)所占比例最多,大约占90%,食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EA)次之,占7%左右,其他几种类型均少见。由于早期症状不明显,缺乏及时发现和早期诊断的有效方法,临床上首次确诊的食管鳞癌患者80%以上为中、晚期,其5年生存率不及20%,预后极差。因此,对患者进行早诊断、早治疗以及寻找诊断食管癌有效的分子生物学标记意义重大。微小RNA(micro RNA,mi RNA,mi R)是一类长度为19-24个核苷酸的单链非编码小分子RNA,通过与靶基因的3’UTR区特异性结合抑制靶基因m RNA翻译或将其降解,从而在转录后水平起到基因沉默效应,参与调控细胞增殖、分化和凋亡等生理功能,且与肿瘤的发生、发展等密切联系。Mi R-1由mi R-1-133表达簇编码,其分别位于第18(18q11)和20(20q13)常染色体上,为成熟mi R-1和mi R-133编码。mi R-1最初作为肌特异性mi RNA在心肌和骨骼肌中发现,参与心肌和骨骼肌的生成。最近研究发现,mi R-1在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用。研究表明,mi R-1在多种肿瘤中异常表达,如在结肠癌、膀胱癌与肾癌中都表达下调,发挥抑癌基因的作用,但其表达与食管鳞癌临床病理资料及其可能作用机制的研究少有报道。有多项研究证实,肌动蛋白骨架蛋白1(LIM和SH3蛋白1,LIM and SH3 protein 1,LASP1)和肌动蛋白结合蛋白2(Transgelin-2,曾译为转胶蛋白)在多种恶性肿瘤的增殖、侵袭和发展过程中起非常重要作用,并证明他们是mi R-1的靶基因,而此两种癌基因在食管鳞癌方面的研究少见报道且其与mi R-1在食管鳞癌中的关系也未见报道。本研究采用逆转录实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测mi R-1在食管鳞癌组织和其配对正常组织中的表达,深入分析mi R-1的表达水平与食管鳞癌患者临床病理关系。同时进行mi R-1的过表达或沉默,并通过MTT实验、流式细胞术检测凋亡和周期、Transwell实验,研究其对食管鳞癌细胞株Eca109增殖、凋亡和周期、迁移和侵袭能力的影响,利用双荧光素酶报告基因分析检测mi R-1对其预测靶基因LASP1和TAGLN2的靶向作用。同时检测食管鳞癌组织和其配对正常组织中LASP1和TAGLN2的表达情况,分析其与mi R-1表达水平的关系。并在最后探讨了血浆mi R-1作为肿瘤标记物的可能性。主要研究内容和结果如下:第一部分mi R-1、LASP1和TAGLN2在食管鳞癌中的表达及其与临床病理特征关系的研究目的:通过检测mi R-1、LASP1和TAGLN2在食管鳞癌组织和配对正常组织中的表达,探讨其在食管鳞癌中的表达情况及其与食管鳞癌患者临床病理特征的关系。方法:采用q RT-PCR技术检测mi R-1在55例食管鳞癌组织和配对正常组织中的表达,回顾性分析其表达水平与食管鳞癌患者的临床病理特征关系。食管鳞癌患者的临床病理特征包括患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况及脉管瘤栓情况等。选择与侵袭转移相关的癌基因LASP1和TAGLN2,分别采用q RT-PCR和免疫组织化学法检测其在食管鳞癌组织和配对正常组织的表达水平,探讨其表达水平与食管鳞癌患者的临床病理特征关系。另外,分析了mi R-1与癌基因LASP1和TAGLN2的相关性。结果:1 mi R-1在食管鳞癌组织和配对正常组织中的表达水平。应用q RT-PCR检测55例食管鳞癌组织和配对正常组织中mi R-1的表达水平,结果发现,食管鳞癌组织中mi R-1的表达水平低于相应的癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P0.05)。2 mi R-1的表达与食管鳞癌患者临床病理特征间的关系。55例食管鳞癌患者中,mi R-1的相对表达水平与食管鳞癌患者的年龄、性别、肿瘤位置和肿瘤大小无明显关系(P0.05),而与食管鳞癌的淋巴结转移、组织学分级和脉管瘤栓等有关(P=0.002,P=0.000,P=0.022)。3 LASP1和TAGLN2在食管鳞癌组织和配对正常组织中的表达水平。采用q RT-PCR和免疫组化法检测与肿瘤侵袭和转移相关的癌基因LASP1和TAGLN2在55例食管鳞癌组织和配对正常组织中的表达水平,结果发现,食管鳞癌组织中LASP1和TAGLN2的表达水平显著高于相应的癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P0.05)。4 LASP1和TAGLN2的表达与食管鳞癌患者临床病理特征间的关系。55例食管鳞癌患者中,LASP1和TAGLN2的相对表达水平与食管鳞癌患者的年龄、性别、肿瘤位置和肿瘤大小无明显关系(P0.05),而与食管鳞癌的淋巴结转移、组织学分级和脉管瘤栓等有关(P=0.000,P=0.000,P=0.008和P=0.000,P=0.001,P=0.008)。5食管鳞癌组织中mi R-1与LASP1和TAGLN2的表达呈负相关。经Spearman秩相关性检验分析发现,在LASP1低表达的食管鳞癌组织标本(24例)中,mi R-1高表达的标本占66.7%(16例/24例);而LASP1高表达的标本(31例)中,mi R-1低表达的标本占87.1%(27例/31例);mi R-1与LASP1蛋白表达水平呈负相关(r=-0.45,P0.05)。在TAGLN2低表达的食管鳞癌组织标本(24例)中,mi R-1高表达的标本占50.0%(12例/24例);而TAGLN2高表达的标本(31例)中,mi R-1低表达的标本占74.2%(23例/31例);mi R-1与TAGLN2蛋白表达水平呈负相关(r=-0.382,P0.05)。结论:1 mi R-1在食管鳞癌组织中表达显著低于配对正常组织,而LASP1和TAGLN2在食管鳞癌组织中表达显著高于配对正常组织。2 mi R-1、LASP1和TAGLN2在食管鳞癌组织中的表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、组织学分级和脉管瘤栓等有关。3 mi R-1与癌基因LASP1和TAGLN2存在显著负相关关系,提示mi R-1可能在食管鳞癌的侵袭转移方面发挥重要作用。第二部分mi R-1对食管鳞癌细胞生物学行为影响的体外实验研究目的:研究mi R-1对于食管鳞癌细胞生物学行为包括细胞增殖、细胞凋亡和周期、侵袭和转移的影响。方法:体外转染mi R-1模拟物或是抑制物或其阴性对照,通过MTT、流式细胞术、细胞迁移和侵袭实验在体外观察mi R-1在食管鳞癌细胞Eca109增殖、凋亡和周期、侵袭和转移中发挥的作用。结果:1 mi R-1对食管鳞癌细胞株Eca109细胞增殖能力的影响。MTT细胞增殖实验检测结果显示,食管鳞癌细胞在24 h、48 h、72 h细胞增殖率mimics-mi R-1组与mimics-mi R-1 control组比较降低,而inhibitor-mi R-1组与inhibitor-mi R-1 control组比较增高,差异具有统计学意义(P0.05),表明mi R-1对食管鳞癌细胞增殖具有抑制作用。2 mi R-1对人食管鳞癌细胞株Eca109细胞凋亡与周期的影响。流式细胞技术检测结果显示,在转染48h后,mimics-mi R-1组与mimics-mi R-1 control组比较和inhibitor-mi R-1组与inhibitor-mi R-1 control组比较,Eca109细胞在凋亡率和细胞周期方面未发生明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。3 mi R-1对人食管鳞癌细胞株Eca109细胞侵袭转移的影响。Transwell分析结果显示,mimics-mi R-1组与mimics-mi R-1 control组相比,mimics-mi R-1组Eca109细胞迁移和侵袭到下室的细胞数明显少于mimics-mi R-1 control组(P0.05),说明其迁移和侵袭能力明显减弱;inhibitor-mi R-1组与inhibitor-mi R-1 control组比较,inhibitor-mi R-1组Eca109细胞下室的细胞数明显增多,说明其迁移和侵袭能力明显增强,差异具有统计学意义(P0.05)。两组实验结果一致,说明mi R-1基因能够影响Eca109细胞的迁移和侵袭能力。结论:mi R-1可抑制食管鳞癌细胞Eca109的增殖、迁移和侵袭能力,而对细胞凋亡和周期无影响。第三部分mi R-1调控LASP1和TAGLN2表达的实验研究目的:探讨食管鳞癌中mi R-1对于LASP1和TAGLN2表达的相关调控关系。方法:运用Micro RNA生物信息学网站和软件,对其可能的作用靶序列进行预测分析,结合mi R-1在食管鳞癌细胞中发挥的生物学功能,进行进一步筛选。通过双荧光素酶报告基因分析的方法检测mi R-1对其预测靶基因LASP1和TAGLN2的靶向作用,采用Western-blot验证食管鳞癌细胞株Eca109中mi R-1对其预测靶基因表达的影响。结果:1生物信息学软件预测靶基因,并双荧光素酶验证mi R-1对LASP1和TAGLN2的靶向作用。生物信息学软件Target Scan预测结果提示,mi R-1序列可以分别与LASP1和TAGLN2 m RNA的3’-UTR区相结合,其两者可能为mi R-1的靶基因。我们进一步通过双荧光素酶报告基因系统检测了mi R-1与LASP1和TAGLN2基因m RNA 3’-UTR区结合位点的活性。结果显示,转染mimics-mi R-1后能够显著降低食管鳞癌细胞Eca 109中LASP1和TAGLN2的相对荧光强度,分别是对照组转染了mimics-mi R-1 control的42%和31%,差异具有统计学意义(P0.05),提示LASP1和TAGLN2是mi R-1的下游调控靶分子,mi R-1与LASP1和TAGLN2的3’-UTR结合后对它们进行负性调控。2在食管鳞癌细胞株Eca109中过表达mi R-1对LASP1和TAGLN2蛋白表达的影响Western blot检测mi R-1转染48 h后,实验组及对照组靶基因LASP1和TAGLN2蛋白表达变化。结果显示,mimics-mi R-1组的LASP1和TAGLN2蛋白表达水平低于其对应mimics-mi R-1 control组,而inhibitor-mi R-1组的LASP1和TAGLN2蛋白表达水平高于其对应inhibitor-mi R-1 control组,具有统计学差异(P0.05)。结论:1 mi R-1可以通过与LASP1和TAGLN2的m RNA 3’-UTR区结合抑制其表达,证明LASP1和TAGLN2是mi R-1的靶基因。2在食管鳞癌患者中mi R-1可能是通过LASP1和TAGLN2途径调控食管鳞癌的发展。第四部分血浆mi R-1作为食管鳞癌肿瘤标志物的潜在诊断价值的研究目的:研究食管鳞癌患者外周血中mi R-1的表达情况,探讨其在食管鳞癌诊断中的应用。方法:采集23例初治食管鳞癌患者及11例体检健康人的血浆标本,提取RNA后采用逆转录实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测血浆mi R-1表达水平,分析其与食管鳞癌临床病理参数的关系;同时比较其中10对术前和术后7~10 d食管鳞癌患者手术前后mi R-1表达水平的变化;绘制受试者工作特征曲线并分析其诊断食管鳞癌的价值。结果:1食管鳞癌患者和健康对照组血浆中mi R-1的表达水平。应用实时荧光定量PCR检测食管鳞癌组与健康对照组血浆中mi R-1的表达水平,结果发现,食管鳞癌患者比对照组健康人血浆中mi R-1的表达显著降低,差异具有统计学意义(P0.01)。2血浆mi R-1在食管鳞癌患者手术前后表达变化。食管鳞癌患者术后7-10 d外周血中mi R-1的表达水平较术前显著升高,差异具有统计学意义(P0.01)。3血浆mi R-1表达与食管鳞癌患者临床病理特征间的关系。血浆mi R-1的相对表达水平与食管鳞癌患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小均无明显相关性(P0.05);但与淋巴结是否转移显著相关(P=0.005);与组织学分级呈负相关,但统计学无差异(P=0.083)。4血浆mi R-1在食管鳞癌诊断中的价值。以23例食管鳞癌患者及11例健康对照者血浆mi R-1的相对表达量绘制ROC曲线,分析显示,通过检测血浆mi R-1水平来区分健康人和食管鳞癌患者的曲线下面积是0.881[95%的置信区间(confidence interval,95%CI):0.743-1],临界值取0.688时,其特异度87%,灵敏度81.8%(P0.01)。结论:1血浆mi R-1在食管鳞癌患者中的表达明显下调,且食管鳞癌术后mi R-1表达上调。2血浆mi R-1有望成为用于食管鳞癌筛查的新型分子标志物。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

【参考文献】