全反式维甲酸对食管癌细胞系EC1 angiopoietin-Tie2信号通路的影响

发布时间：2019-05-22 11:28

【摘要】：背景食管鳞状细胞癌(ESCC)是河南省常见肿瘤,具有较强的侵略性和较差的预后,在临床回顾性研究中是仅次于胃癌的致死肿瘤。辅助治疗,化疗、放疗和内镜治疗没有改善晚期食管癌患者的存活率。在肿瘤的发生发展过程中,血管生成是肿瘤发展转移的关键步骤,为肿瘤生长及扩散、转移提供丰富的营养。多种血管生成相关因子参与肿瘤血管生成的过程。研究最为广泛、深入的因子是血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体(VEGFR),特别是Flt-1与KDR,调控着肿瘤新生血管的生成,并且促进了多种恶性肿瘤的生长、转移[1-3]。除此之外还有促血管生成素(angiopoietins,Ang)及其受体Tie-2构成的Ang/Tie-2信号传导系统在血管生成中也起着重要的调节作用。全反式维甲酸(ATRA)是维生素A的活性成分,影响涉及较为广泛的生物学过程,包括生长、增殖、神经功能、免疫功能、生殖等。它是最有效的、重要的诱导分化剂,尤其是在急性早幼粒细胞白血病的临床治疗当中发挥重要作用。ATRA在几个肿瘤血管生成模型里都有抑制转移的潜力。本研究通过体内外实验观察ATRA通过维甲酸受体(RAR)对食管癌细胞系EC1中Ang-1,Ang-2,Tie-2,VEGF和VEGF受体VEGFR(Flt-1,KDR)蛋白水平和mRNA水平表达的影响,为ATRA在食管鳞癌抗血管生成的治疗中提供理论依据。目的探究不同浓度的ATRA对体内外食管鳞癌细胞系EC1的增殖、迁移活力的影响,对EC1中血管生成相关因子Ang-1,Ang-2,Tie-2,VEGF和VEGFR(Flt-1和KDR)mRNA及蛋白水平表达的影响。方法终浓度分别为0、0.1、1、10μmol/L的ATRA,10μmol/L的AM80以及浓度为100mg/L的氟尿嘧啶作用于体外的人食管鳞癌EC1细胞,并且采用CCK-8法评价ATRA对食管鳞癌细胞的增殖及细胞活力的抑制情况,并证实ATRA可以通过诱导细胞的凋亡信号通路激活Caspase3、Cl-caspase3,PARP、Cl-PARP等,从而杀伤细胞;通过划痕实验检测ATRA对于EC1作用24h前后的细胞迁移能力的抑制作用;采用蛋白印迹法(western blot)和逆转录酶聚合链式反应(RT-PCR)分别检测不同浓度ATRA作用于EC1 24h后Ang-1,Ang-2,Tie-2,VEGF和VEGFR(Flt-1和KDR)蛋白和m RNA水平的表达情况。在体内实验中,将处于对数生长期的EC1细胞种植于裸鼠肩胛区,监测裸鼠荷瘤后给药对体重及肿瘤大小的影响;用免疫组织化学法检测EC1形成的瘤体组织内Ang-1,Ang-2,Tie-2和CD31的表达,从而评价ATRA对肿瘤血管生成的影响。结果1.CCK-8结果:作用于24h后,实验组,即0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100 mg/L Fluorouracil组相对于对照组的增殖抑制率分别为:13.7%、22.0%、29.5%、29.9%;48h后,上述实验组的增殖抑制率分别为:24.2%、33.9%、40.3%、41.2%。经统计学分析,ATRA及氟尿嘧啶处理组分别与对照组相比,差异均具有统计学意义(P0.05),ATRA处理组之间进行两两比较,差异也具有统计学意义(P0.05)。2.细胞划痕实验结果:作用于24h后,实验组,即0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100 mg/L Fluorouracil组相对于0h的细胞的迁移率分别为15.8%、43.3%、87.1%、96.9%。ATRA及氟尿嘧啶处理组分别与对照组相比,差异均具有统计学意义(P0.05),ATRA处理组之间进行两两比较,差异也具有统计学意义(P0.05)。3.PCR结果:与对照组相比,0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100mg/L Fluorouracil组作用于EC1细胞48h后,Ang-1的mRNA表达量标准化后,均有不同程度降低,抑制率依次为:52%、69%、80%、73%(Fig 3B).Ang-2的mRNA表达量标准化后,均有不同程度降低,抑制率依次为:30%、55%、69%、66%.Tie-2的mRNA表达量标准化后,均有不同程度降低,抑制率依次为:27%、76%、94%、94%(Fig 3B).可以看出,随着药物浓度的增加,Ang-1,Ang-2和Tie-2的表达量均有下降趋势,经统计学分析,ATRA及氟尿嘧啶处理组分别与对照组相比,差异均具有统计学意义(P0.05),ATRA处理组之间进行两两比较,差异也具有统计学意义(P0.05)。4.Western blot结果:0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L ATRA及100 mg/L Fluorouracil作用于EC1细胞48h后,Ang-1,Ang-2和tie-2的蛋白表达量与对照组相比均有不同程度下降。Ang-1的表达抑制率分别为36%、40%、35%、87%(Fig 4C).Ang-2的表达抑制率分别为36%、40%、35%、87%(Fig 4D).Tie-2的相对表达抑制率为15%、6%、22%、68%.可以看出,随着药物浓度的增加,Ang-1,Ang-2和Tie-2的表达量均有下降趋势,经统计学分析,ATRA及氟尿嘧啶处理组分别与对照组相比,差异均具有统计学意义(P0.05),ATRA处理组之间进行两两比较,差异也具有统计学意义(P0.05)。5.体内实验结果:在第0天,将1x106个EC1细胞接种到裸鼠肩胛部分皮下。荷瘤10天后,将可见瘤体的裸鼠随机分为4组,1组为安慰剂组,3组分别灌胃ATRA(0.1,1,和10 mg/kg/day)。在荷瘤20天后处死裸鼠。荷瘤前后,药物处理前后测量并记录裸鼠重量。根据裸鼠体重判断其恶病质状态,观察到ATRA处理组可以减轻恶病质状态。将各处理组的瘤体组织剥离并按组排序,并进行拍照。肿瘤大小计算:宽×长度。计算各处理组中裸鼠瘤体大小。用免疫组织化学法测量皮下瘤体组织的CD31,Ang-1,Ang-2和Tie-2的表达水平。可以发现ATRA抑制荷瘤裸鼠上EC1瘤体的增长,并且改善荷瘤裸鼠的恶病质状态。结论1、ATRA能通过激活食管鳞癌细胞系EC1细胞的凋亡通路诱导细胞凋亡,并且抑制细胞增殖,并且ATRA的杀伤细胞作用具有剂量和时间依赖性。2、ATRA可以抑制EC1细胞的迁移,抑制Ang-1、Ang-2、Tie-2,VEGF和VEGFR的mRNA和蛋白的表达,并且具有剂量和时间增效效应。3、ATRA可能通过下调Ang-1;Ang-2;Tie-2、VEGF、Flt-1和KDR等基因的表达水平,影响食管癌细胞学EC1细胞中新生血管的生成,从而抑制肿瘤的生长。4、ATRA抑制荷瘤裸鼠上EC1瘤体的增长,并且改善荷瘤裸鼠的恶病质状态。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1

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