PLCE1对食管癌生物学行为的影响及相关miRNAs调控机制初步研究

发布时间：2019-05-28 08:46

【摘要】：第一部分PLCE1表达对食管鳞癌细胞生物学行为的影响目的：探讨PLCE1蛋白在不同食管病变组织中的表达及临床意义：观察PLCE1基因对食管鳞癌细胞株生物学功能学的影响；初步研究PLCE1基因在食管鳞癌中可能调控的下游分子和信号通路。方法：(1)收集石蜡包埋的112例新疆汉族食管鳞癌组织、99例食管鳞癌癌前病变组织(低级别上皮瘤变60例,高级别上皮内瘤变39例)和99例癌旁正常组织,制备组织芯片,应用免疫组化检测PLCE1蛋白的表达并分析其与食管鳞癌临床病理特征及与食管鳞癌患者预后的关系；(2)检索PubMed,MEDLINE,EMBASE,Web of science,维普,CNKI数据库,收集从建库至2014年8月期间关于PLCE1蛋白表达与食管鳞癌相关性的文献,将符合入选标准的文献按研究方法归类整理原始数据汇总后进行Meta分析和统计处理,分析评价PLCE1蛋白与食管鳞癌患者临床病理参数的相关性。(3)用PLCE1特异性的siRNA转染食管鳞癌细胞系,运用MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,检测不同处理对凋亡和增殖相关蛋白的表达影响;利用transwell小室侵袭实验检测不同处理下食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力及对上皮间叶转化相关标记物的表达影响,应用免疫荧光检测不同处理组细胞的形态和骨架蛋白F-actin的表达变化情况；应用MTT法、流式细胞仪观察并检测iTNF-α、 TRAIL、Paclitaxel、5-FU对沉默PLCE1基因后的食管鳞癌细胞的细胞增殖抑制及凋亡的变化。(4)应用人类表达谱芯片Affymetrix3'IVT对不同处理组细胞进行基因芯片分析,筛选出差异表达基因,并利用生物信息学进行GO分析和KEGG、PATHWAY分析。结果：(1)PLCE1蛋白的表达主要位于食管鳞癌细胞的胞浆,正常组织、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、食管鳞癌组织中PLCE1蛋白的高表达率分别为2.03%(2/99)、58.33%(35/60)、72.50%(28/39)和73.22%(82/112),PLCE1蛋白在癌组织中的表达明显高于正常组织(免疫组化评分：6.768±0.2717vs1.707±0.1416,P0.001),高级别上皮内瘤变组织中的表达明显高于正常组织(免疫组化评分：7.103±0.4312vs1.707±0.1416,P0.001),低级别上皮内瘤变组织中的表达明显高于癌旁正常组织(免疫组化评分：6.333±0.3808vs1.707±0.1416,P0.001),鳞癌组织中的表达明显高于低级别上皮内瘤变组织(免疫组化评分：6.768±0.2717vs6.333±0.3808,P=0.046)。(2)PLCE1蛋白表达与食管鳞癌发病性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、分化及浸润深度等临床病理特征没有统计学意义(P=0.253,0.309,0.787,0.542,0.418,0.467),但其高表达与临床TNM分期(P=0.024)及淋巴结的转移(P=0.021)密切相关。Kaplan-Meier生存分析发现PLCE1蛋白高表达与食管鳞癌患者生存时间明显低于低表达患者(log-rank test, x2=10.243, P=0.001)。用Cox回归模型进行食管鳞癌预后因素筛选发现,在包括年龄、性别、吸烟、肿瘤大小、组织类型、分化程度、淋巴结转移、临床分期的多因素分析中,PLCE1蛋白的表达(HR：8.435,95%CI=1.875-37.983,P=0.005)可以作为独立因素影响食管鳞癌患者的预后因素。(3)在meta分析PLCE1表达与ESCC临床病理关系的研究中,共纳入4篇参考文献(总计388例食管鳞癌患者,117例正常对照),结果显示PLCE1表达与肿瘤的进展有密切关系(pooled OR=5.93;95%CI=3.86-9.11),而与肿瘤的浸润深度(pooled OR=1.54;95%CI=0.84to2.82)、分化(pooled OR=1.55;95%CI=0.71-3.36)和淋巴结的转移(pooled OR=2.83;95%CI=0.89-9.06)无明显关联(P0.05)。(4)转染入PLCE1siRNA质粒后,MTT和单克隆形成实验显示食管鳞癌细胞的生长受到明显抑制、食管鳞癌细胞株的细胞团数明显减少,流式细胞实验显示经过PLCE1siRNA转染的食管鳞癌细胞株与对照组相比,早期和晚期凋亡的比率明显升高(P0.05),食管鳞癌细胞株中凋亡相关蛋白Bax和cleaved-PARP的表达量明显增高。Transwell实验显示经转染PLCE1siRNA质粒的食管鳞癌细胞株的形态由原来的长梭形变为椭圆形,其侵袭和迁移能力明显降低;PLCE1基因被干扰后,其上皮的标记物E-cadherin明显升高,而间叶的标记物Vimentin则明显下降。免疫荧光实验报告显示干扰PLCE1表达后,细胞骨架蛋白F-actin的表达明显降低。(5)PLCE.1基因被干扰后,食管鳞癌细胞经TNF-α、TRAIL、 Paclitaxel、5-FU处理后,其细胞数量明显减少,凋亡比例明显增高。可见,PLCE1可增加食管鳞癌细胞对TNF-α、TRAIL、Paclitaxel和5-FU药物的抵抗。(6)利用表达谱芯片筛选转染PLCE1siRNA人食管鳞癌细胞前后的差异表达基因223个,其中上调基因168个,下调基因55个,这些基因主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、蛋白酶活性、肿瘤侵袭和转移等方面,涉及的通路有MAPK通路,粘着斑形成,Axon guidance, p53通路,Starch and sucrose metabolism, ECM-receptor interaction, Toll样受体信号通路,D-Glutamine and D-glutamate metabolism, Cytokine-cytokine receptor interaction, Glutamate metabolism等。结论：(1)PLCE1在食管鳞癌及癌前病变组织中的表达明显高于正常组织的表达,其高表达与食管鳞癌患者预后差密切相关且是影响食管鳞癌患者预后的独立因素：(2) PLCE1不但可促进食管鳞癌细胞的增殖并抑制其凋亡,还可以增强食管鳞癌细胞对细胞因子和化疗药物的耐药性,且其可以通过影响骨架蛋白表达及上皮间叶转化来调控食管鳞癌细胞的侵袭转移。第二部分食管鳞癌中PLCE1相关miRNA互相调控机制初步研究目的：(1)阐明miR-145靶向调控PLCE1表达对食管鳞癌细胞生物学特性的影响；(2)筛选并探讨PLCE1在食管鳞癌中可以调控的miRNA及其下游靶基因在食管鳞癌发生中的作用机制。方法：(1)运用生物信息学预测可能靶向调控PLCE1的miRNAs,应用荧光素酶报告实验验证PLCE1是miR-145的靶基因,观察miR-145通过调控PLCE1对食管鳞癌细胞生物学行为的影响,应用实时定量PCR检测食管鳞癌组织及其正常食管组织中miR-145和PLCE1的表达情况,分析它们之间的相关性。(2)运用Affymetrix GeneChip miRNA3.0Arrays芯片来筛选PLCE1基因可能调控的下游miRNAs分子并进行验证。(3)对验证得出的miR-106b分子在食管鳞癌细胞中进行生物功能学的研究;应用荧光素酶报告实验验证RBL1和RBL2是miR-106b的靶基因；观察PLCE1通过调控miR-106b以及靶基因进而对食管鳞癌细胞生物学行为的影响。(4)应用实时定量PCR检测食管鳞癌组织和正常食管组织中miR-106b的表达,应用免疫组化检测368例食管鳞癌组织和215例正常食管组织中RBL2蛋白的表达情况,并联合分析PLCE1蛋白、miR-106b和RBL2蛋白表达的相关性。结果：(1)运用生物信息学软件进行对可能靶向调控PLCE1基因的miRNAs进行预测,结果我们发现miR-145为三个软件共同预测的分子。通过在食管鳞癌细胞系中检测两者的表达情况,初步确认PLCE1与miR-145可能存在一定的负向调控关系。通过转染miR-145mimcs和inhibitor对PLCE1表达的调控作用以及应用荧光素酶报告实验,发现在食管鳞癌细胞系中miR-145可靶向调控PLCE1的表达。(2)miR-145可显著抑制食管鳞癌细胞的增殖,促进食管鳞癌细胞的凋亡,并可通过调控细胞的骨架从而抑制食管鳞癌细胞的迁移能力,增强miR-145表达且转染PLCE1siRNA介导的PLCE1基因沉默能更加显著的降低食管鳞癌的增殖和侵袭能力。(3)与癌旁正常食管组织相比,miR-145在癌组织中表达显著降低(癌组织41.92±9.089,正常组织104.4±13.00,P=0.0002),miR-145的表达与淋巴结转移(N0：66.54±32.47,N1-3：25.89±9.95,P=0.0002)和临床分期密切相关(T1/2：54.01±21.86,T3/4：31.03±15.77,P=0.0381)。食管鳞癌组织样本中miR-145mRNA表达与PLCE1蛋白存在着明显的负相关关系(r=-0.472,P=0.008)。(4)运用Afffymetrix GeneChip miRNA3.0Arrays芯片检测PLCE1可能调控的miRNAs分子,我们发现miR-106b-5p和miR-93可被PLCE1显著上调。通过实时定量PCR检测发现在沉默PLCE1后,miR-106b和miR-93表达显著下调,初步在食管鳞癌细胞中确认PLCE1与miR-106b和miR-93存在显著的正向调控关系。(5)miR-106b可显著促进食管鳞癌细胞的增殖和迁移,抑制食管鳞癌细胞的凋亡。初步验证得出RBL2和RBL1为miR-106b的靶基因。增强miR-106b表达可部分逆转siRNA介导的PLCE1基因沉默导致的食管鳞癌细胞增殖和侵袭能力降低,并且也部分逆转PLCE1基因沉默导致的食管鳞癌细胞凋亡增加。(6)与正常食管组织相比,miR-106b-5p在癌组织中表达显著增高(P=0.0211),RBL2在癌组织中表达显著降低(P0.0001)。食管鳞癌组织样本中PLCE1蛋白表达与miR-106b表达之间存在正相关关系(R=0.4814,P=0.0431),食管鳞癌组织样本中PLCE1蛋白表达与RBL2蛋白表达之间存在负相关关系(R=-0.2934,P=0.0015),食管鳞癌组织样本中miR-106b表达与RBL2蛋白表达之间存在负相关关系(R=-0.6143,P=0.0014)。结论：(1)miR-145通过负性调节PLCE1表达而抑制食管鳞癌细胞增殖和侵袭。(2)PLCE1基因可通过显著上调miR-106b表达而促进食管鳞癌细胞增殖和迁移并抑制凋亡。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1

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