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非小细胞肺癌循环肿瘤DNA含量与EGFR突变检测关系的研究

发布时间：2019-05-30 15:12
【摘要】：目的肺癌是全球范围内导致癌症相关性死亡的首要原因,严重危害着人类健康。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常见的类型,约占肺癌总数的80%。目前依据基因型的靶向治疗已经成为NSCLC的标准治疗方案之一。临床应用靶向药物前需要进行基因检测以选择受益人群。传统的组织活检用于突变检测存在一定的局限性,近年来循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)作为“液体活检”的检材备受关注,大量文献比较了应用组织和ctDNA进行突变检测的一致性,但各实验室之间结果差异较大,归结原因应该是血浆ctDNA含量差异造成的。本研究拟通过分析ctDNA含量水平与突变检测准确性之间的关系,确定取得可靠突变检测结果时的ctDNA水平。同时探讨了利用细胞毒性药物增加ctDNA含量进而提高基因突变检测正确度的理论可行性。方法用EGFR T790M突变的人NSCLC细胞株H1975构建裸鼠移植瘤模型36只,自然生长至不同肿瘤大小后,取血提取cfDNA。设计4对引物,分别扩增长度为81bp、297bp的人LINE-1基因和长度为120bp、338bp的鼠ACTB基因。用Q-PCR方法分别测定来自H1975细胞的人源ctDNA(以下表示为hctDNA)和来自裸鼠自身的鼠源cfDNA(以下表示为mcfDNA)的含量,以长片段hctDNA(或mcfDNA)含量与短片段hct DNA(或mcfDNA)含量比值作为cfDNA的完整性指数(DII)。同时用微滴式数字PCR技术检测EGFR T790M突变,分析突变检测结果与hctDNA含量和肿瘤重量的关系。此外,分别将顺铂用于体外培养NSCLC细胞株和给荷瘤鼠腹腔灌注顺铂,采用上述方法测定培养基上清和鼠血浆中ctDNA含量,分析化疗药物在体内外促进ctDNA释放的规律。统计分析采用SPSS17.0软件。结果1.36只荷瘤鼠瘤重为0.06g~2.26g,裸鼠血浆中的hctDNA呈偏态分布,其含量(ng/ml)表示为中值±四分位距(范围):短片段hctDNA含量6.43±25.93(0.37~186.76),长片段hctDNA含量0.34±0.95(0.01~25.46),人源DII为0.040±0.044(0.009~0.268)。mcfDNA呈正态分布,其含量(ng/ml)表示为均值±标准差(范围):短片段mcfDNA含量76.71±34.64(6.41~147.44),长片段mcfDNA含量28.13±12.01(4.72~46.66),鼠源DII为0.397±0.121(0.187~0.736)。无论是hctDNA还是mcfDNA均以短片段cfDNA含量代表实际cfDNA含量。hct DNA与mcfDNA含量之比其中值±四分位距(范围)为0.086±0.406(0.004~3.918)。2.血浆mcfDNA的含量、鼠源DII与肿瘤重量无关。血浆hctDNA含量与肿瘤的重量呈正相关,rs=0.85,P0.001;人源DII与肿瘤重量呈负相关,rs=-0.34,P=0.042。hct DNA与mcfDNA的比值随肿瘤重量的增加而增大,呈正相关,rs=0.76,P0.001。3.36例样本中,检出突变22例,其每毫升血浆突变拷贝数中值±四分位距(范围)105.00±231.86(21~4140),未检出突变14例。22例检出突变的阳性样本中,其肿瘤重量为0.22g~2.26g,hctDNA含量中值±四分位距(范围)为18.24±39.23(1.40~186.76),hctDNA与mcfDNA的比值为0.236±0.465(0.039~3.918)。14例未检出突变的阴性样本中,其肿瘤重量为0.06g~0.55g,hct DNA含量(ng/ml)范围2.92±2.91(0.37~16.82),hctDNA与mcfDNA的比值为0.053±0.058(0.004~0.462)。4.突变检出阳性样本中,每毫升血浆突变拷贝数与肿瘤重量呈正相关,rs=0.42,P=0.049;同时,每毫升血浆突变拷贝数也与hct DNA含量呈正相关,rs=0.432,P=0.045。突变检出阳性样本中其hctDNA含量、肿瘤重量和hctDNA/mcfDNA之比显著高于突变检出阴性样本(P0.05)。hctDNA含量≥6ng/ml者突变检出率为89.47%,hctDNA6ng/ml者突变检出率为29.41%。如以肿瘤重量(0.45g)或hctDNA/mcfDNA之比(0.08)为标准,两组突变检出率都分别为84.21%和35.29%。5.顺铂作用于A549、H520细胞后,ctDNA在36~48h时间段内释放量最大,上清液中ctDNA含量达181~260ng/ml。6.荷A549裸鼠给药后,其血浆中ct DNA随给药时间而变化,先逐渐上升,峰值出现在给药后48h,ctDNA含量为416.81±62.25ng/ml,之后下降并趋向于正常水平。结论1.mcfDNA含量及鼠源DII与肿瘤大小无关;hctDNA含量与肿瘤大小呈正相关,人源DII与肿瘤大小呈负相关。随着肿瘤增大,hct DNA的含量增加,完整性下降。表明荷瘤鼠血浆中cfDNA来源于鼠正常细胞的比较稳定,来自肿瘤细胞的与肿瘤负荷呈正比。2.以cfDNA为检材进行突变检测,突变检出率与肿瘤大小、hctDNA含量呈正相关,当hctDNA含量达到一定水平时,突变检测结果才可靠。鉴于血浆cfDNA中来自正常细胞的部分较为稳定,在临床实际应用中可以考虑用总cfDNA含量代替hct DNA作为突变检测的参考指标。3.细胞毒性药物可以促进ctDNA的释放,在ctDNA释放高峰时间点采血可显著增加血浆ctDNA含量,进而提高突变检测的可靠性。在临床实践中有望利用这一规律在患者接受化疗后肿瘤细胞释放ctDNA的高峰期采血,提高液体活检的可靠性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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