3-溴丙酮酸增强肝癌细胞对索拉菲尼敏感性的研究

发布时间：2019-05-31 01:22

【摘要】：目的通过体内体外实验探索3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvate,3-Br PA)联合索拉菲尼(Sorafenib,SOR)对人肝癌细胞SMMC7721、Hep G2的抑制作用及其相关分子机制。方法1.首先采用MTT法检测不同浓度3-Br PA(0,20,40,80,160μmol/L)、索拉菲尼(0,2,4,8,16μmol/L)以及100μmol/L3-Br PA与索拉菲尼(0,2,4,8,16μmol/L)联合对肝癌细胞SMMC7721、Hep G2的增殖抑制作用;之后实验分为对照组、3-Br PA组、SOR组、3-Br PA+SOR组;2.集落克隆实验检测3-Br PA联合索拉菲尼对肝癌细胞增殖抑制作用;3.DAPI染色检测3-Br PA联合索拉菲尼对SMMC7721、Hep G2细胞核的变化;4.PI单染流式细胞术检测3-Br PA联合索拉菲尼诱导SMMC7721、Hep G2细胞凋亡;5.线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测3-Br PA联合索拉菲尼对肝癌细胞线粒体膜电位的影响;6.活性氧检测试剂盒检测3-Br PA联合索拉菲尼对SMMC7721、Hep G2细胞胞内活性氧水平的影响;7.ATP检测试剂盒检测3-Br PA联合索拉菲尼对肝癌细胞ATP水平的影响;8.Western blot检测3-Br PA联合索拉菲尼对SMMC7721、Hep G2细胞Mcl-1、Bcl-2、Bax以及PARP蛋白表达的影响;9.建立裸鼠的异体移植瘤模型,观察3-Br PA联合索拉菲尼的体内抗肿瘤效果。结果1.3-Br PA增强索拉菲尼对SMMC7721和Hep G2细胞增殖的抑制作用1.1 3-Br PA、索拉菲尼以及两药联合作用于SMMC7721、Hep G2细胞,肝癌细胞存活率随浓度增高而降低(P0.05)。100μmol/L3-Br PA与索拉菲尼联合作用于SMMC7721、Hep G2细胞24 h的存活率显著低于同浓度的索拉菲尼单独处理(P0.05)。1.2 100μmol/L3-Br PA、16μmol/L索拉菲尼以及两药联合作用于人肝癌SMMC7721、Hep G2细胞24h后,联合用药组于单独用药组相比,细胞失去正常形态,细胞间隙明显增宽,悬浮细胞数量明显增多。1.3为进一步3-Br PA联合索拉菲尼对人肝癌SMMC7721、Hep G2细胞的增殖抑制作用,选择60μmol/L3-Br PA与6μmol/L索拉菲尼联合作用于人肝癌SMMC7721、Hep G2细胞6-8d,进行集落形成实验,验证3-Br PA联合索拉菲尼对肝癌细胞增殖的抑制作用。结果显示3-Br PA能明显增强索拉菲尼对肝癌细胞SMMC7721和HepG2的增殖抑制作用。2.3-Br PA增强索拉菲尼诱导的肝癌细胞SMMC7721和Hep G2凋亡100μmol/L 3-Br PA联合16μmol/L索拉菲尼作用于肝癌细胞SMMC7721和Hep G2细胞24h,JC-1检测结果显示,与对照组和单独用药组相比,联合用药组红色荧光明显减弱,绿色荧光明显增强,说明3-Br PA能增强索拉菲尼引起的线粒体功能发生障碍,3-Br PA增强索拉菲尼诱导的人肝癌细胞SMMC7721和Hep G2细胞发生早期凋亡。我们通过ROS检测试剂盒检测了细胞内ROS水平,用3-Br PA诱导人肝癌细胞6h后,与单独用药组相比,联合用药组肝癌细胞内ROS水平明显增高。100μmol/L3-Br PA与16μmol/L索拉菲尼联合作用于人肝癌SMMC7721、Hep G2细胞24h后,使用DPAI荧光染色检测两药联合对人肝癌SMMC7721、Hep G2细胞核的影响,结果显示联合用药组细胞表现为细胞核皱缩浓集,呈现亮蓝色荧光,或细胞核呈分叶、碎片状,且明显多于单独用药组;100μmol/L 3-Br PA联合16μmol/L索拉菲尼作用于肝癌SMMC7721和Hep G2细胞24h,PI单染后流式细胞仪检测细胞凋亡情况,结果显示联合用药组诱导肝癌细胞SMMC7721、Hep G2的凋亡率为(47.4±5.02)%、(46.2±4.14)%,明显高于对照组和单独用药组(P0.05)。3.3-Br PA联合索拉菲尼对SMMC7721和Hep G2细胞内ATP水平的影响通过ATP检测试剂盒检测了100μmol/L 3-Br PA联合16μmol/L索拉菲尼处理SMMC7721和Hep G细胞5h后细胞内ATP水平的变化。实验结果显示经过3-Br PA联合索拉菲尼处理5h后,联合用药组SMMC7721细胞ATP水平降至(18.5±2.63)%,Hep G细胞ATP水平降至(22.3±4.14)%,与单独用药组比较均有明显的降低(P0.05)。4.3-Br PA与索拉菲尼联合能增加细胞内活性氧水平,抑制细胞内活性氧水平可以降低3-Br PA与索拉菲尼诱导的肝癌细胞凋亡通过ROS检测试剂盒检测了100μmol/L 3-Br PA联合16μmol/L索拉菲尼处理SMMC7721和Hep G细胞6h后细胞内ROS水平的变化。结果显示在SMMC7721细胞中联合用药组细胞内ROS水平明显增高。通过NAC(5mmol/L)对细胞ROS水平加以抑制,联合用药组SMMC7721细胞的存活率为(51.2±4.78)%,Hep G2细胞的联合用药组细胞存活率为(22.5±5.86)%。加用NAC后SMMC7721细胞的存活率为(87.2±5.45)%,Hep G2细胞的联合用药组细胞存活率为(79.4±4.89)%。结果显示通过NAC抑制细胞ROS水平,可以明显降低3-Br PA联合索拉菲尼诱导的肝癌细胞凋亡(P0.05)。5.3-Br PA联合索拉菲尼对SMMC7721、HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响Western blot结果显示联合用药组明显下调肝癌细胞Mcl-1、PARP和Bcl-2的表达(P0.05),但对促凋亡蛋白Bax的表达无明显影响。6.3-Br PA可以增强索拉菲尼体内抗肿瘤效果建立人肝癌Hep G细胞的异种植瘤裸鼠模型,进行联合用药的体内抗肿瘤实验。用药第28天处死裸鼠,测量肿瘤体积并称重。对照组、3-Br PA组、索拉菲尼组以及联合用药组的肿瘤体积分别为654.83±141.95 mm3、113.07±43.22 mm3、157.42±47.04 mm3、28.71±7.48mm3,结果显示于单独用药组相比,联合用药组肿瘤体积明显减少,差异有统计学意义(P0.05),说明3-Br PA联合索拉菲尼在体内具有良好的抗肿瘤作用,HE染色后在显微镜下观察并拍照,结果显示与对照组和单独用药组比较,联合用药组中组织血管减少,分布混乱,出现大面积的坏死区域,说明3-Br PA能增强索拉菲尼在裸鼠体内的抗肿瘤效果。结论1.3-Br PA具有增强索拉菲尼对肝癌细胞SMMC7721、Hep G2的增殖抑制作用,且能增强索拉菲尼诱导肝癌细胞的凋亡;2.3-Br PA与索拉菲尼联合能增加细胞内活性氧水平,抑制细胞内活性氧水平可以降低3-Br PA与索拉菲尼诱导的肝癌细胞凋亡;3.3-Br PA与索拉菲尼联合可以下调Bcl-2、Mcl-1与PARP的表达;4.3-Br PA可以增强索拉菲尼在体内的抗肿瘤作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【相似文献】