PTPN1促进食管癌细胞侵袭运动的分子机制研究

发布时间：2019-07-04 08:00

【摘要】：PTPN1 (Protein Tyrosine Phosphatase Non-receptor type 1)是一种非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶,主要通过调节细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平发挥功能,参与细胞增殖、生长和迁移的多个细胞信号通路的调节。研究表明,PTPN1在多种肿瘤组织中表达异常,并参与多种肿瘤的发生发展。我们在前期工作中发现PTPN1在食管癌组织中存在高表达,是CRT促进食管癌肺转移的关键下游分子。本研究旨在进一步深入探讨PTPN1促进食管癌细胞侵袭运动的分子机制。首先,我们通过在食管癌细胞中敲降PTPN1验证了PTPN1可正向调控食管癌细胞的侵袭运动能力。同时,我们发现敲降PTPN1可降调EGFR表达和Erk1/2的活性。通过siRNA敲降EGFR和抑制剂抑制Erk1/2的活性,我们验证了EGFR-Erk1/2通路对食管癌细胞侵袭运动能力的正向调控,并通过回复实验证实了PTPN1主要通过激活EGFR-Erk1/2通路增强食管癌细胞的侵袭运动能力。接着,我们通过Realtime PCR、MG132等实验发现PTPN1主要在mRNA水平调控EGFR的表达,进一步的核质分离实验和免疫荧光检测表明PTPN1可促进EGFR的转录因子Spl的浆核易位。为深入研究PTPN1对EGFR-Erk1/2通路以及食管癌细胞侵袭运动能力的调节机制,我们通过GST Pull-down联合LC/MS/MS技术高通量筛选了PTPN1在食管癌中潜在的相互作用蛋白共358个,并利用免疫共沉淀和免疫荧光技术对其中的高分候选分子MYH9在食管癌细胞中和PTPN1的相互作用进行了验证。MYH9为非肌型肌球蛋白重链ⅡA,参与细胞迁移、粘附及胞质分裂等多个过程,被报道与多个蛋白包括Spl的异常定位相关,而其与PTPN1的相互作用尚未见文献报道。为确定MYH9的调控作用,我们在食管癌细胞中敲降MYH9,发现食管癌细胞的侵袭运动能力和EGFR的蛋白及mRNA水平显著降低,并伴随着Spl的核浆易位。然而MYH9的ATPase抑制剂Blebbistatin并不能影响食管癌细胞的侵袭能力和EGFR的表达,进一步的回复实验证实MYH9的杆状尾部在MYH9对EGFR的调控中起到关键作用。以上结果提示MYH9可能通过其杆状尾部而不依赖其细胞骨架功能完整性介导PTPN1对食管癌细胞侵袭运动能力和EGFR蛋白表达的调控。为进一步确定MYH9是否为PTPN1的关键下游分子,我们首先通过Phos-tag技术以及免疫沉淀法联合广谱酪氨酸磷酸化抗体检测发现PTPN1可促进MYH9的酪氨酸去磷酸化。结合数据库信息,我们利用PTPN1底物捕获突变体和MYH9杆状尾部的非磷酸化突变体证实了PTPN1直接作用于MYH9的Y1408位点。接着,我们使用PTPN1的活性损伤突变体验证了PTPN1通过其酪氨酸磷酸酶活性促进食管癌细胞的侵袭运动和EGFR的表达,并通过MYH9杆状尾部的持续磷酸化突变体和非磷酸化突变体的回复实验证实了MYH9杆状尾部的Y1408非磷酸化形式在PTPN1促进EGFR表达中的关键作用。本研究揭示PTPN1在食管癌细胞中通过MYH9提高EGFR蛋白表达而促进食管癌细胞侵袭运动的分子机制,为进一步阐明PTPN1在食管癌发生发展中的作用提供了新的线索。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

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