Gankyrin在四氯化碳诱导的肝损伤及其恶性转化中的作用和机制研究

发布时间：2019-07-13 16:09

【摘要】：研究背景和目的肝癌发生是一个慢性的、多基因、多途径、多阶段的复杂过程。肝癌最主要的危险性因素包括慢性肝炎病毒感染(HBV和HCV)、长期过量酒精摄入、食物中黄曲霉毒素B1摄入、遗传性肝病和肝硬化等。近年来,人们研究发现代谢疾病如糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝病等也是肝癌发病的危险因素。大量临床流行病学研究证实,大部分肝癌都是在慢性肝损伤、肝脏炎症背景下发展而来,通常经由慢性肝病发展到肝纤维化、肝硬化,最后恶化形成肿瘤。肝脏的慢性损伤和炎症背景为肿瘤形成提供了合适的细胞转化环境。目前,肝癌发生特别是从慢性肝损伤恶性转化形成肿瘤的确切分子机制尚不完全清楚。Gankyrin又称为(p28或PSMD10)是在肝癌中高表达的癌蛋白。近几年的研究表明Gankyrin还在其他肿瘤,包括食管鳞状细胞癌、结肠癌、胆管癌、口腔上皮细胞癌以及肺癌等多种肿瘤中高表达。研究显示Gankyrin在肿瘤相关的信号转导中具有非常重要的调控作用。研究发现Gankyrin可与p16竞争性结合CDK4,促进RB蛋白的磷酸化降解,导致肿瘤细胞周期紊乱,促进增殖：还可通过与MDM2相互作用,增加p53的泛素化降解,抑制肿瘤细胞凋亡。本实验室前期研究结果还表明Gankyrin可直接结合RelA,促进NF-κB出核,抑制其转录活性；可通过激活PI3K/AKT信号通路,促进肝癌的侵袭和转移；能通过抑制Oct4的降解,增强肝癌肿瘤前体细胞干细胞潜能。这些结果表明Gankyrin通过调控多条重要的信号通路,在肝癌的恶性进展中发挥着重要作用。在DEN诱导的大鼠肝癌模型中,除了在肝癌组织中高表达外,Gankyrin在肝损伤及肝纤维化阶段即出现表达上调,这提示我们Gankyrin可能在肝癌发生的早期阶段或者说在肝损伤、肝纤维化向肝癌恶性转化过程中发挥着调控作用。目前尚未见到Gankyrin在肝损伤及肝癌发生的癌前阶段发挥作用的相关报道,本课题旨在通过在肝脏特异性过表达癌蛋白Gankyrin的转基因小鼠基础上构建经由慢性肝损伤、肝纤维化、肝硬化到肝癌的动物模型,研究Gankyrin在这一恶性进展过程中的作用及机制。实验方法：1.临床组织样本检测：免疫组织化学染色及western blot法检测肝硬化患者肝脏组织样本中Gankyrin的蛋白表达水平,并分别利用Image J和Odyssey软件进行半定量分析,统计肝硬化样本与血管瘤远端正常肝组织中Gankyrin表达的差异。2. Gankyrin过表达转基因小鼠构建、繁殖与鉴定：构建由Albumin启动子连接gankyrin全长cDNA的载体,以构建Gankyrin在肝脏中特异性过表达的转基因小鼠(gankyrinhep小鼠)。将Found鼠与野生小鼠交配,繁殖得到Fl代gankyrinhep小鼠,经鉴定后,用于后续扩增繁殖与实验研究。3.四氯化碳(Carbon Tetrachloride, CCl4)诱导肝损伤模型构建：每周3次CCl4注射,持续16周,收取不同时间点的小鼠样品,检测肝损伤及纤维化相关指标。小鼠血清ALT和AST水平测定检测肝功能；肝脏HE染色,检测肝脏的组织结构和肝细胞坏死情况；TUNEL染色检测肝细胞凋亡情况；western blot检测凋亡相关分子变化;利用天狼星红染色检测野生组和gankyrinhep组肝纤维化情况；收集肝组织RNA,行real-time PCR,检测肝纤维化相关标志物变化；肝组织切片进行a-SMA免疫组化和DESMIN免疫荧光染色检测肝星状细胞活化情况；F4/80免疫组化检测炎症细胞侵润情况；收集小鼠血清行ELISA检测相关炎症因子分泌情况。4.小鼠肝癌动物模型构建：DEN诱癌模型,小鼠出生后15天腹腔注射DEN后9个月后观察野生对照组与转基因组的肝癌形成情况；DEN联合CCl4诱癌模型,DEN处理联合分笼后每周一次CCl4给药,不同时间后观察两组之间肿瘤形成情况差异；持续CCl4诱癌模型,小鼠出生后4周后腹腔注射CCl4,每周三次,16周后观察肿瘤形成情况。5.机制探索：(1)不同时间点CCl4处理的野生对照和gankyrinhep小鼠肝脏样品中检测JNK及其他相关通路变化情况；CCl4处理2周后分选小鼠原代肝细胞,western blot检测JNK通路活化情况。(2)CCl4处理的小鼠肝脏组织样品进行Racl激酶活性检测；免疫共沉淀检测gankyrin对RhoGDIa与Racl抑制性相互作用的影响。(3)2周CCl4处理的小鼠肝脏组织样品进项RhoA、ROCK激酶活性检测；免疫共沉淀检测gankyrin对RhoGDIa与RhoA相互作用的影响。(4)对CCl4处理小鼠同时给予Racl小分子抑制剂处理小鼠2周,检测对JNK活性的调节。(5)对CCl4处理小鼠同时给予JNK抑制剂或Rac1抑制剂,western blot检测凋亡相关分子变化；天狼星红染色检测肝纤维化情况；ELISA检测炎症因子分泌情况。(6)CCl4处理小鼠16周期间同时给予JNK抑制剂3个月,观察肝脏肿瘤形成情况。实验结果：1.与正常肝脏样本肝硬化患者肝脏组织中gankyrin表达升高(P0.05)。2.短时间CCl4处理的gankyrinhep组肝细胞坏死和凋亡较野生对照组多,即肝损伤加重。3.CCl4处理2周、4周和8周时,gankyrinhep组的肝纤维化以及星状细胞活性化均较野生组增强；gankyrinhep组的肝脏损伤及炎症反应加重,同时代偿性增殖明显高于野生对照。4. DEN/CCl4诱导肝癌形成过程中gankyrinhep组的肿瘤数目和肿瘤大小均明显高于野生对照组：同时肝纤维化在gankyrinhep组明显加重;而DEN诱癌模型中,gankyrinhep组与野生对照组肿瘤形成情况无明显差异。5.CCl4单独处理16周后在gankyrinhep组有50%小鼠形成肿瘤,而在野生组无肿瘤形成。6.CCl4处理的gankyrinhep组呈现JNK通路相对野生对照组持续增强活化。7.CCl4处理的gankyrinhep组的Rac1激酶持续活化；gankyrin通过抑制RhoA/ROCK通路进而活化Rac1; Rac1抑制剂处理导致gankyrinhep组JNK活性恢复至野生水平。8.JNK抑制剂或Rac1抑制剂均能缓解CCl4诱导的gankyrinhep组的细胞凋亡增加和炎症因子分泌增多。9.JNK抑制剂可有效抑制长期CCl4处理后gankyrinhep组肝癌形成。结论：本研究主要从动物体内水平证明Gankyrin对CCl4诱导的肝损伤向肝癌进展的恶性转化具有促进作用。Gankyrin通过调节RhoGDI与RhoA的相互作用,下调RhoA的活性,进而增强Racl活性,导致CCl4处理过程中JNK通路的持续活化,促进肝损伤加重,炎症反应加强,肝细胞代偿性增生加强,肝纤维化加重并恶性转化,最终导致肝癌形成。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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