中草药单体雷公藤内酯酮诱导细胞完全老化的抗急性髓细胞白血病新策略及机制研究

发布时间：2019-08-13 13:11

【摘要】：白血病系造血系统的一种恶性疾病,又称血癌,预后较差。近十年来,我国的白血病发病率、死亡人数均呈逐年上升趋势,平均每年增加10%左右,白血病已成为危害我国人民生命和健康的重要疾病。在我国急性白血病比慢性白血病多见(约5.5:1),在急性白血病中又以急性髓细胞白血病(AML)为主,如得不到有效治疗,病程进展迅速,短者数天就能引起患者死亡。AML是一种异质性、多基因的病变,有150多个癌基因与白血病的发生密切相关,其发病机制复杂;病理学特征主要表现为白血病细胞增殖过度、分化障碍、凋亡受阻、老化缺陷。长期以来,AML的治疗是以化疗为主,主要是通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和诱导细胞分化三方面起作用,但对诱导白血病细胞老化缺乏研究。临床现有AML药物由于特异性差,毒性大,易产生耐药性,常导致AML疗效不佳和白血病复发,AML的治疗仍面临挑战,亟需研发出新的抗白血病有效药物。在正常个体,骨髓造血干细胞分化成各种血系的终末细胞和发挥其功能后,细胞就启动了一个完全老化的过程,表现为不可逆的细胞生长停滞、程序性的细胞死亡,最终被机体的免疫系统清除。而白血病细胞中通常发生老化缺陷,细胞不能进入完全老化程序,肿瘤细胞变为永生化。同时,也有部分白血病细胞发生不成熟老化,表现为暂时的细胞周期阻滞,细胞处于一种休眠的状态。但不幸的是多种致癌因素能够重新激活这种不成熟老化细胞,引起细胞恶性增殖,导致白血病复发。目前临床上诱导白血病细胞老化的有效药物缺如。在这种严峻的形势下,因此我们提出了白血病治疗的科学问题:诱导白血病细胞老化是否能够有效地抗白血病?中医药是我国伟大的宝库,我们能否从医药宝库中发掘新型抗白血病药物?根据我们的前期研究结果,我们提出了一个科学假设:通过诱导白血病细胞完全老化,能够有效地抗白血病;并设计了一系列的实验来研发能够诱导白血病细胞完全老化的抗白血病药物。近年来,我们采用现代科学技术,从祖国医药宝库中发掘新型抗癌药物,应用急性髓细胞白血病细胞模型,在国内外首先发现中草药单体雷公藤内酯酮(Triptonide)能够诱导人原髓细胞白血病细胞HL60和人单核细胞白血病细胞U937完全老化,并显著抑制白血病细胞的生长和致瘤性,发挥抗癌效应,且毒性小。主要实验结果如下:(1)中草药单体雷公藤内酯酮能够显著抑制HL60和U937细胞的生长和集落生成,其半数抑制浓度分别为11.8和7.5 nM;体内小鼠移植瘤实验显示雷公藤内酯酮几乎能完全抑制HL60细胞的致瘤能力,抑瘤率大于99%。(2)雷公藤内酯酮能够诱导HL60和U937细胞体积增大、细胞核难以分裂、细胞核中颗粒增多,细胞出现老化的形态学改变;雷公藤内酯酮能够诱导HL60和U937细胞老化相关β-半乳糖苷酶(β-gal)活性染色和老化相关异染色质集落(SAHF)形成。(3)机制研究显示,雷公藤内酯酮通过抑制端粒逆转录酶(TERT)的启动子活性和c-Myc转录因子(促进TERT基因的转录)的表达,使TERT基因在白血病中的表达降低;同时上调抑癌基因p16和p21的表达,促进白血病细胞周期阻滞和诱导细胞老化。此外,雷公藤内酯酮还能上调白血病细胞中促凋亡基因-DNA损伤诱导转录因子3(DDIT3)的表达,促进细胞凋亡。这些效应均是由于雷公藤内酯酮选择性地激活白血病细胞中丝裂原活化蛋白激酶-3(MKK3)/p38信号通路介导的,最终使白血病细胞完全老化,发挥抗癌效应。综上所述,雷公藤内酯酮通过抑制白血病细胞中老化关键基因TERT的表达、上调老化重要基因p16和p21的表达,同时激活MKK3-p38-DDIT3信号通路,诱导白血病细胞完全老化,导致老化细胞凋亡,发挥抗癌效应。我们的实验研究证实我们的科学假说,通过诱导白血病细胞完全老化能够有效地抗白血病。这为新一代抗白血病药物的研发提供了新的研究策略和候选药物。
【图文】：

图谱,细胞

图1：PGL4.17图谱ERT 基因和 DDIT3 基因启动子活性的测定（化学发光实验）组质粒的细胞转染：正常培养 HL60 细胞至对数生长期，离心细胞连同 3ug 重组质粒和 1ug 内参共同加入到 100ul 电转液中转染进 HL60 细胞。PGL4.17 质粒作为阴性对照，PGL4.51 质电转杯置于 Lonza 细胞核电转仪中，启动电穿孔程序。程序六孔板中进行培养，48h 后更换含有 500ng/ml G418 的 1640选稳定转染的阳性 HL60 细胞株。阳性 HL60 的对数生长期细胞，接种于 6 孔板中，然后分别用酯酮处理细胞，于 37℃、5%CO2培养箱培养 72 小时。收集药物作用后的细胞制备蛋白裂解液，，分别取 20 μL 进行化加入荧光素酶底物后反应 5 秒，立即用化学发光仪进行荧光化学发光荧光值。

雷公藤内酯酮,集落形成,U937细胞,HL60细胞

雷公藤内酯酮非常显著地抑制HL60细胞和U937细胞集落形成能力
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71

【引证文献】