高三尖杉酯碱抗急性髓系白血病作用的分子靶标鉴定及其作用机制研究

发布时间：2019-08-27 07:02

【摘要】：研究背景：高三尖杉碱酯(Homoharringtonine, cephalotaxine,4-methyl2-hydroxy-4-meth-ylpentyl butanedioate [ester],简称HHT,别名高粗榧碱)是从我国特有三尖杉属植物海南粗榧(Cephalotaxus harringtonia)(常绿乔木)中分离得到的天然生物碱,在纳摩尔(nanomolar concentration, nM)浓度就能杀伤肿瘤细胞,是一种非常有效的抗癌剂。在中国,HHT被用来作为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)联合化疗方案的一个关键组成部分,广泛使用已经超过30年。最近的一项多中心、开放、随机对照的III期临床试验显示,对于原发性AML患者,基于HHT的诱导方案HAA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷+阿柔比星)取得了较高(73%)的完全缓解率(complete remi ssion rate, CR),显着高于目前治疗AML的国际标准方案(柔红霉素联合阿糖胞苷)的57.3%；并且其3年无事件生存率(3-year event-free survival)为35.4%比23.1%,从而成为原发性AML的标准诱导缓解方案。然而,临床上不同白血病患者对HHT的治疗反应是迥然不同的。HHT对部分患者有良好的治疗效果,能达到完全缓解,但也有一部分患者不但没有收到疗效,甚至出现了骨髓抑制等严重后果。因此,寻找HHT抗白血病作用的分子靶标,并阐明其作用的具体分子机制无疑有助于最大限度发挥HHT抗白血病作用并减少HHT相关的毒副作用。以往一些研究认为核糖体是HHT介导的蛋白质翻译抑制的候选靶标之一,其主要依据是晶体结构研究。该研究显示HHT与氨基酸侧链的氨酰基-tRNA相竞争,结合在核糖体的肽基转移酶中心的A位。然而,在此共结晶结构模型中使用的HHT浓度为1毫摩尔(mM),这是HHT用于杀伤肿瘤细胞nM浓度的10万倍,提示HHT结合到核糖体的亲和力可能不高。不排除在这一高浓度下,HHT非特异性结合到核糖体的可能。此外,如果核糖体是HHT的一个关键靶标,HHT处理后应抑制全部蛋白质的合成。然而,文献研究发现HHT选择性地抑制一些半衰期短的致癌蛋白的合成,c-Myc, cyclin-D1, Mcl-1等,但对管家基因编码的蛋白质,如GAPDH和β-actin并没有明显影响,这是核糖体作为HHT的主要靶分子所不能解释的。因此,我们推测尚有未知的关键的分子靶标可能参与HHT介导的抗肿瘤活性。文献报道指出,真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor4E, eIF4E)在具有短半衰期的致癌蛋白或者促生存蛋白的mRNAs转运过程中发挥了关键性的作用；并且在AML-M5患者中eIF4E过表达。巧合的是,我们最近的研究发现p-eIF4E水平在AML-M5患者中高度上调。结合既往的研究结果,使我们有理由相信HHT可能通过作用于p-eIF4E发挥抑制白血病细胞增殖的作用。本研究中,我们首先应用生物素标记的HHT分离和鉴定可能与HHT作用的eIF4E和p-eIF4E蛋白质分子靶标,然后通过系列体外和小鼠体内实验手段和方法系统研究HHT与其靶标之间相互作用的分子机制,为明确HHT临床应用的适应症提供科学理论依据。研究目的： 1、分离和鉴定高三尖杉碱酯抗急性髓系白血病作用的分子靶标； 2、初步阐明高三尖杉碱酯与其分子靶标p-eIF4E相互作用的分子机制； 3、明确高三尖杉碱酯对高表达分子靶标p-eIF4E的入急性髓系白血病细胞在小鼠体内的生长抑制作用； 4、明确高三尖杉碱酯分子靶标p-eIF4E在人髓系白血病原代样本及正常血细胞样本中的表达情况。研究内容与结果： 1. p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病活性的一个关键靶标为了明确HHT是否特异性地影响AML细胞中的p-eIF4E水平,通过Western blotting检测HHT对p-eIF4E和t-eIF4E的作用。用HHT处理AML-M5细胞系THP-1白血病细胞24小时导致p-eIF4E水平的抑制,呈剂量依赖,而t-eIF4E水平则不受影响。同样,在原代AML细胞中也观察到了类似结果。并且HHT对p-eIF4E水平的影响呈时间依赖。为观察HHT是否存在抑制其他信号分子的脱靶效应,我们检测HHT对MNKl和Mcl-1的抑制作用。在显着抑制eIF4E磷酸化的浓度,HHT对磷酸化的MNK1没有明显的影响,而Mcl-1的水平则表现出与p-eIF4E平行的下降,表明p-eIF4E水平的下降不是非特异性毒性作用的结果。上述结果有力地表明HHT特异性地降低p-eIF4E及其下游靶蛋白Mcl-1。为了评估HHT介导的p-eIF4E的减少是否与其抗白血病活性有关,通过MTT试验和Western blotting技术来研究细胞存活率和p-eIF4E蛋白下降的关系。我们用一定浓度的HHT作用THP-1细胞48小时,可以观察到HHT介导的抗白血病活性和p-eIF4E抑制呈正相关,相关系数为0.87。为了进一步证实上述结果,接下来我们选择了6个具有不同的抑制细胞增殖能力的HHT结构类似物,分别检测其在THP-1细胞的抗增殖活性和p-eIF4E的抑制作用,发现HHT类似物抗细胞增殖的IC50值和p-eIF4E的抑制是显着相关的,相关系数为0.98。这些结果强有力地说明HHT可能是抑制白血病细胞生长的特异的p-eIF4E的拮抗剂。 2. HHT特异性下调白血病细胞p-eIF4E水平为了确认上述实验结果,我们采用生物素标记的HHT (HHT-biotin)来捕获白血病细胞中的p-eIF4E蛋白和eIF4E蛋白。采用THP-1细胞的全细胞裂解产物与HHT-biotin孵育,然后用亲和素磁珠来沉淀与HHT-biotin相互作用的蛋白分子复合物。经过充分的洗涤,在沉淀产物中检测到p-eIF4E和t-eIF4E.与此相一致的是,我们通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色实验检测到p-eIF4E蛋白条带,并通过Western blotting和蛋白质谱分析(Mass Spectroscopic analysis)得到确认。为了检测纯化的p-eIF4E蛋白是否与HHT相互作用,进一步通过pull-down实验证实HHT-biotin是结合到p-eIF4E蛋白的。为了揭示在白血病细胞中HHT结合p-eIF4E的细胞定位,用生物素标记的HHT(HHT-biotin)、生物素(biotin)和HHT作用THP-1细胞12小时,通过p-eIF4E抗体的免疫荧光染色,观察其与HHT-biotin的共定位情况。结果显示HHT-biotin在整个细胞浆和细胞核内均有分布,但主要定位于核p-eIF4E. 为了进一步验证上述实验结果,我们用HHT(100ng/ml)作用THP-1细胞12h或者24h,通过免疫荧光染色来评估p-eIF4E和t-eIF4E在白血病细胞的分布。结果显示HHT作用12小时,核p-eIF4E水平大大减少,在24小时基本消失,但t-eIF4E无明显影响。并且我们还观察到,伴随核p-eIF4E的消失,HHT促进核p-eIF4E在细胞核周边和胞浆的聚集。Western blotting实验也显示HHT作用能显着降低THP-1细胞核p-eIF4E水平。这些研究结果表明,在白血病细胞,HHT主要结合于p-eIF4E,特别是核p-eIF4E。 3. p-eIF4E209位磷酸化丝氨酸是HHT结合的关键位点之一为了揭示HHT结合p-eIF4E的潜在结合位点,通过计算机分子对接模型,我们发现201a.a.到212a.a.是HHT结合eIF4E的关键位点。我们模拟了25纳秒(ns)时磷酸化S209(p-eIF4E)、磷酸化S209-敲除(eIF4E-△209S)与HHT的相互作用,结果显示为了获得更强的蛋白-配体相互作用,p-eIF4E中的环区移向HHT分子,K206的重要组成部分氧原子与HHT分子形成氢键。另一方面,在eIF4E-△209S内的环区因为局部螺旋的形成而失去其灵活性,因此它与HHT分子的结合力是比较弱的。这可以通过检查环区与HHT的最小距离来进一步说明。模拟p-eIF4E、 eIF4E和eIF4EA209S在0-25ns与HHT的相互作用,我们发现这个环区是灵活的,并且最终在17ns时p-eIF4E与HHT形成紧密而稳定的作用,两者的最小距离为2.8A；然而对于eIF4E-△209S的模拟显示,该环区始终远离HHT分子,距离达到8A；对于eIF4E,也没有观察到其与HHT稳定的相互作用。上述分子对接模型结果表明,相比于eIF4E-△209S和eIF4E, p-eIF4E蛋白对HHT具有更大的亲和力。为了鉴定HHT结合eIF4E的具体氨基酸位点,我们构建了一系列eIF4E的突变体,包括W56,W73,W102和Ser209缺失的突变体,通过转染HEK293细胞检测HHT结合到这些突变体的能力。选择这些突变体的主要原因是W73与泛素／降解相关,W56和W102涉及帽结合活性,而S209则是其磷酸化位点。结果显示,Ser209缺失的突变体消除了eIF4E与HHT的结合,这与上述计算机模拟结果一致,而其他氨基酸残基的突变,包括eIF4E56W,73W和102W缺失,并不影响eIF4E与HHT的结合。这些结果表明磷酸化Ser209位点是HHT结合eIF4E的关键,并且p-eIF4E与HHT结合的亲和力远高于eIF4E. 4.HHT通过增加SUMO化促进蛋白酶体依赖的p-eIF4E蛋白降解已知eIF4E是小泛素化蛋白(SUMO)底物之一。为明确SUMO化修饰是否参与HHT介导的p-eIF4E的下降,我们评估了白血病细胞中HHT对p-eIF4E和SUMO结合酶UBC9的影响。结果显示,HHT处理THP-1细胞3小时,p-eIF4E从细胞裂解液的上清转移到不溶性颗粒,伴随出现UBC9的增加。HHT处理24小时后,大部分的p-eIF4E从上清液转移到不溶性颗粒,提示HHT增加p-eIF4E在髓系白血病细胞中的变性水平。这些结果与免疫荧光观察到的结果即HHT诱导p-eIF4E在细胞核周边和胞浆的聚集相一致。进一步,我们发现蛋白酶体抑制剂MG132强烈阻止白血病细胞中HHT诱导的p-eIF4E蛋白水平的下降,提示HHT可能触发p-eIF4E的蛋白酶体依赖的降解。接下来我们研究HHT是否通过增加SUMO化使p-eIF4E变性?使用HEK293细胞转染表达FALG-eIF4E、FALG-eIF4E-△209S的质粒,然后用／不用HHT处理12h。细胞裂解物用抗FALG M2磁珠进行免疫沉淀,随后用anti-SUMO1、anti-SUMO2/3或者anti-FALG抗体通过western blotting技术进行分析。结果显示：HHT处理后,用anti-SUMO2/3抗体检测,发现野生型eIF4E在25kDa以上有多条条带,但是在eIF4E-△209S突变却未检测到；而且无法用anti-SUMO1抗体检测到上述条带,并且HHT (100ng/ml)增加了SUMO化p-eIF4E的寡聚化。这些结果表明HHT处理增加了SUMO2/3介导的p-eIF4E的SUMO化。此外,Ser209的磷酸化是HHT介导的p-eIF4E的SUMO化的关键。为了进一步明确上述结果,在白血病细胞中,我们对HHT诱导的UBC9结合到p-eIF4E的水平做进一步的分析,发现HHT增加UBC9结合到p-eIF4E,呈时间依赖。这些结果表明,HHT诱导SUMO2/3分子介导的p-eIF4E蛋白的SUMO化,通过增加UBC9与p-eIF4E的亲和力,这反过来导致p-eIF4E蛋白酶体依赖的降解。因此,我们提出HHT诱导p-eIF4E降解的工作模型：HHT特异性结合到p-eIF4E的201-212a.a.,导致构象变化,这有利于p-eIF4E的寡聚化和SUMO化,最终导致蛋白酶体依赖的降解。 5. HHT对p-eIF4E高表达的人AML-M5原位小鼠移植瘤的生长抑制作用为了获得HHT根除p-eIF4E高表达的AML细胞的体内证据,我们把表达高水平p-eIF4E的THP-1细胞注射到NSG小鼠体内,建立了具有侵袭性的人AML-M5原位小鼠模型。每天按0.5mg或1.0mg/kg体重的HHT剂量腹腔给药,1天1次,连续14天。经过HHT处理大大降低了白血病负荷,并且生存时间延长,呈现剂量依赖。用高剂量HHT(1.0mg/kg体重)可以完全根除小鼠体内的AML-M5细胞,且到80天时所有小鼠仍处于无病生存。这些结果表明HHT结合于p-eIF4E,使其具有根除表达高水平p-eIF4E的AML的潜能。 6. p-eIF4E在部分AML患者中异常上调,而在正常个体中未见表达或低表达已有文献指出eIF4E在部分白血病患者中是高表达的,但p-eIF4E在人急性髓系白血病患者中是否表达目前未见任何报道。因此,我们通过western blotting技术检测了7例人AML细胞系,16例不同的AML原代样本,20例健康成年捐赠的正常造血细胞样品中的p-eIF4E和eIF4E蛋白水平。结果显示7例AML细胞均表达高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白,16例原代样本中有13例(81.25%)表达高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白,但在20例健康成年中,8例表达低水平的p-eIF4E蛋白,12例不表达p-eIF4E蛋白。上述结果表明,相比于正常个体,p-eIF4E蛋白水平在部分AML患者中是高度上调的。研究结论： 1. p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病作用的重要靶标之一； 2. p-eIF4E丝氨酸209位磷酸化是HHT结合的关键位点之一； 3. HHT通过增强SUMO化途径促进p-eIF4E进行蛋白酶体依赖的降解； 4.HHT能清除原位NSG小鼠模型体内高表达p-eIF4E的人急性单核细胞白血病细胞； 5. p-eIF4E在部分急性髓系白血病患者原代白血病细胞样本中呈高表达状态。
【图文】：

白血病细胞,中高,急性髓系白血病

图2.1 p-eIF4E在原代AML-M5白血病细胞中高表达p-eIF4E的免疫焚光染色：A为原代AML-M5细胞；B为正常jk细胞(绿色：p-eIF4E蓝色：细胞核DAPI染色）为进一步探讨小分子化合物HHT抗急性髓系白血病作用的分子耗标，以biotin-HHT为分子探针，联合应用蛋白质谱MS和werestn blotting技术和方法筛选并鉴定HHT特异性的作用祀标。还将利用动态计算机分子对接模型（DynamicComputer Molecular Docking Model)模拟HHT与p-eIF4E发生特异性结合的具体对接位点，并且探讨HHT对其把分子的抑制作用。2.2材料与方法2.2.1实验材料

白血病细胞,特异性,调零

活率=(用药孔0D值-调零孔0D值)/(对照孔0D值-调零孔0D值）xlOO%果p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病活性的一个关键乾标了明确HHT是否特异性地影响AML细胞中的p-eIF4E水平，通过Westerng检测HHT对p-eIF4E和t-eIF4E的作用。用不同浓度HHT处理AML-M5THP-1白血病细胞24小时可见p-eIF4E水平随着HHT浓度的增加而不断呈剂量依赖（图2.2)。相反，t-eIF4E水平在不同浓度HHT处理下是不受影图2.2)。同样，在原代AML细胞中也观察到了类似结果(图2.3)。并且我们western blotting实验进一步发现HHT lOOng/ml作用于THP-1细胞，p-eIF4E着作用时间延长而不断下降，表明HHT对p-dF4E蛋白的影响是呈时间依（图2.4)。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

【共引文献】