沉默BubR1对人HBV阳性肝癌细胞增殖的影响及可能机制

发布时间：2019-08-28 20:13

【摘要】：目的:检测BubR1在人肝癌细胞中的表达,观察沉默BubR1后对人HBV(Hepatitis B virus)相关肝癌细胞增殖、凋亡和周期的影响,验证BubR1和HBx(HBV X protein)蛋白的相互关系以及BubR1影响肝癌细胞活性可能的机制。方法:1.运用RT-PCR及Western Blot技术检测人HBV阳性肝癌细胞株(HepG2.2.15)及HBV阴性肝癌细胞株(HepG2、SMMC7721和Huh7)中BubR1的表达,并筛选出Bub R1高表达细胞株。2.设计并合成3对针对BubR1的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),通过阳离子脂质体法进行瞬时转染。体外培养肝癌细胞,实验共设Nomal组、Control-siRNA组及BubR1-1、BubR1-2、BubR1-3各转染组3.运用RT-PCR及Western Blot技术检测各实验组中BubR1在mRNA和蛋白水平的变化,筛选出沉默效果最好的BubR1-siRNA序列。4.通过MTT比色法检测沉默BubR1后细胞增殖能力的改变,运用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡和周期的改变。5.通过Western Blot技术检测沉默BubR1后各实验组细胞MAPKs各信号通路(ERK1/2、JNK、p38MAPK)节点分子、NF-κB信号通路及凋亡相关蛋白(Bax、Caspase-3)表达量改变,以明确BubR1影响肝癌细胞活性可能的机制。6.通过免疫共沉淀及双色免疫荧光结合激光共聚焦技术分别检测HBx蛋白与BubR1蛋白在HBV阳性肝癌细胞中的相互作用关系及在细胞中的定位。结果:1.RT-PCR及Western Blot结果均显示,在四种肝癌细胞系中,BubR1基因均呈阳性表达,且在HepG2.2.15细胞中BubR1 mRNA和蛋白水平皆呈相对最高表达。2.分别用3对特异性BubR1-siRNAs转染HepG2.2.15细胞,24h和48h后分别提取mRNA和蛋白,发现3个转染组(BubR1-1、BubR1-2、BubR1-3组)的mRNA和蛋白表达水平相比较Nomal组、Control-siRNA组下降,且BubR1-3组抑制效果最明显。3.MTT比色法检测细胞增殖及平板克隆实验发现,BubR-3转染组HepG2.2.15细胞增殖能力较Nomal组、Control-siRNA组明显受到抑制。4.流式细胞术检测显示,BubR1-3转染组细胞的凋亡率增高,G1期细胞显著减少,S期细胞明显增加,即细胞阻滞于S期。5.Western Blot检测显示,沉默BubR1可显著抑制p-ERK蛋白和p-NF-κB蛋白的表达,而p-P38、p-JNK1/2以及各通路非磷酸化蛋白的表达较Nomal组、Control-siRNA组相比无明显变化。6.Western Blot检测显示,沉默BubR1,BubR1-3组中Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达水平较Nomal组、Control-siRNA组增高。6.免疫共沉淀技术显示,琼脂糖珠、BubR1及HBx能够共同形成琼脂糖珠-抗原抗体复合物,HBx与BubR1能直接或间接地结合。双色免疫荧光激光共聚焦检测显示,BubR1及HBx在HepG2.2.15细胞质和细胞核中均有分布,且BubR1与HBx在HepG2.2.15细胞核内共定位。结论:1.抑制BubR1基因的表达可使HBV阳性肝癌细胞株HepG2.2.15增殖能力降低,细胞凋亡增加,细胞阻滞于S期。2.BubR1基因沉默后可能通过影响NF-κB、ERK1/2信号通路途径抑制HBV阳性肝癌细胞的增殖能力,且BubR1可能与HBx相互作用,发挥协同促癌的作用。
【图文】：

综述BubR1蛋白是SAC的重要组成成分，，是一个对着丝粒起反应的多结构域蛋白激酶。哺乳动物BubR1基因定位于染色体15q14-21，是酵母菌Mad3的同源基因，其编码的BubR1蛋白相对分子质量约125 000，由1050个氨基酸残基组成。Yoon等[4]则证实BubR1是由1个KEN盒模体，1个Mad3样域，1个Bub3连接域和1个激酶域组成。BubR1蛋白拥有与酵母菌Mad3蛋白同源性的N末端：招募Blinkin/KNL1连接到着丝粒上的TPR(重复三角四肽)功能域，KNL1是KMN网的核心成分，对染色体着丝点-微管排列相互作用至关重要；用于连接Bub3的GLEBS模体(Gle-2-binding sequence)；以及用于连接Cdc20和APC/C的存在于哺乳动物的KEN盒模体和D盒模[5]。而不同于酵母Mad3的是，哺乳动物BubR1类似于BuB1的激酶结构域则在C端[2]。多年来，人们致力于揭示BubR1激酶作用的底物，然而至今尚未能确认BubR1的激酶活性。有人认为BubR1的C末端激酶域是Bub1扩增导致的伪激酶结构域，因此认为BubR1并没有激酶活性[6]。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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本文编号：2530363