长链非编码MALAT1对胰腺导管癌生物学功能影响及其机制的研究

发布时间：2019-09-10 09:38

【摘要】：胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是目前全球备受关注的恶性肿瘤之一,因其具有恶性程度较高,转移早,手术机会少,容易复发,死亡率高的特点,故有“癌中之王”之称。据统计,2015年PC死亡率位于我国癌症死因第九位。根据美国国家癌症中心预测,至2030年,PC将攀升至癌症死因排行榜第二位。PC的90%以上为胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC),且PDAC患者术后五年中位生存时间小于6个月。随着科学技术的发展,尽管医学诊断和治疗手段有所提高,但PDAC患者的预后没有明显改善,其五年生存率仅约7%。故我们对PDAC的深入研究的重要性不言而喻。近年来,研究已证实长链非编码RNA(long non coding RNA,LncRNAs)参与人类正常发育和异常的病理生理过程;与包括肿瘤在内的人类多种疾病有极其密切的联系,并通过多种方式调控癌症的发生发展和预后。转移相关肺腺癌转录本1(metastasis-associated lung adenocarinoma transcript,MALAT1)是发现最早LncRNAs之一,位于染色体11q13.1上,转录本长8708bp。研究发现MALAT1在人胰腺?肺等组织与其他正常组织相比较高表达;在非小细胞肺癌?胰腺癌?前列腺癌等癌组织中与癌旁组织相比呈高表达,其表达水平与总生存时间呈负相关;并在肿瘤发展中,发挥促进细胞增殖、迁移和侵袭等功能。然而在PDAC中MALAT1的研究甚少,其作用机制尚不清楚?因此,本课题将重点研究MALAT1在PDAC中的表达与临床病理参数的关系,并在体外实验中进一步探讨MALAT1对PDAC细胞生物学功能的影响及其调控机制?应用实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qrt-pcr)技术检测malat1mrna在45例pdac石蜡包埋组织(formalinfixedparaffinembedded,ffpe)和25例邻近正常癌旁ffpe组织(adjacentnormaltissues,ant)中表达,实验结果显示:malat1mrna在pdac组织中表达水平明显高于ant(p=0.009)?应用原位杂交(ish)发现malat1阳性率在pdac组织(77.8%,35/45)明显高于ant(32%,8/25)(p=0.0019)。采用qrt-pcr检测胰腺导管癌细胞系panc-1、miapaca-2、bxpc-3、canpan-1、aspc-1和永生化hpde6c-7细胞中malat1mrna的表达,结果显示:与hpde6c-7比较,malat1mrna表达水平在aspc-1细胞中呈高表达(p0.05);在bxpc-3、miapaca-2、canpan-1细胞中呈低表达(均p0.05);而在panc-1细胞中无显著差异(p0.05)?临床病理参数分析,将45例pdacffpe组织按肿瘤大小(4cm,≥4cm)、浸润深度(t1、t2和t3、t4)、肿瘤临床分期(i、ii和iii、iv)进行组间malat1mrna表达比较。结果显示:malat1mrna表达在肿瘤≥4cm组明显高于肿瘤4cm组(p=0.036);浸润较深组(t3、t4)明显高于浸润较浅组(t1、t2)(p=0.014);临床晚期组(iii、iv)明显高于临床早期组(i、ii)(p=0.0328)?按malat1mrna平均值将45例pdac分为高表达组和低表达组,进行相关性分析,其结果显示:malat1表达与肿瘤大小、浸润深度、肿瘤临床分期呈正相关(r=0.35,p=0.019;r=0.334,p=0.025;r=0.439,p=0.04);而与患者性别、年龄、肿瘤部位、组织分级、淋巴转移、静脉侵袭、神经侵袭、远处转移、肿瘤血清cea水平和肿瘤血清ca199等临床因素无明显相关性(p均0.05)?应用kaplan-meier法绘制生存曲线显示:malat1高表达组患者生存时间明显短于低表达组患者生存时间(p=0.043)。单因素分析显示:pdac的发病部位(hr=2.103,95%ci:0.98-4.650,p=0.013)、肿瘤的浸润深度(hr=2.136,95%ci:0.999-4.965,p=0.021)和malat1的表达水平(hr=1.505,95%ci:1.027-2.205,p=0.036)是独立的预后因素。将单因素结果中p≤0.01的临床参数纳入cox分析回归模型分析显示:pdac的发病部位(hr=3.482,95%ci:1.414-8.547,p=0.007)、malat1mrna的表达水平(hr=1.798,95%ci:1.177-7.747,p=0.007)和神经侵袭(hr=4.631,95%ci:1.86-11.553,p=0.001)是独立的预后因素。roc曲线显示:auc为0.69(95%ci:0.561-0.829,p=0.009),cut-off值为0.1035;malat1在pdacffep中诊断敏感性和特异性是分别为77.8%和60%?在体外实验,设计malat1-shrna慢病毒表达载体,经阳性克隆pcr鉴定、测序分析,结果显示:针对malat1基因的4对shrna链分别成功与质粒pglv3/h1/gfp+puro连接,成功构建了慢病毒malat1-shrna表达载体。经包装、纯化、浓缩后产生的慢病毒滴度为1×108tu/ml。4对慢病毒malat1-shrna转染panc-1和miapaca-2细胞的抑制率为分别14%~61%和17.5%~73.6%,其中malat1-5416,malat1-5543的抑制率下降最为明显,抑制率为61%和73.6%;经嘌呤霉素加压筛选成功构建了panc-1和miapaca-2细胞malat1敲减稳转株。通过qrt-pcr验证,panc-1和miapaca-2细胞malat1敲除率分别为63%和72%。细胞功能学cck-8细胞增殖实验结果显示:敲除malat1后,panc-1和miapaca-2组细胞增殖与空白对照组、阴性对照组相比明显减慢(p0.001)。平板克隆实验显示:敲除malat1后,panc-1和miapaca-2细胞克隆形成能力明显弱于空白对照组、阴性对照组(p0.05)。transwell细胞体外迁移实验结果显示:敲除malat1后,panc-1和miapaca-2细胞迁移到滤膜下表面细胞数量明减少空白对照组、阴性对照组(p0.05);同时transwell细胞体外侵袭实验结果显示:敲除malat1后,panc-1和miapaca-2细胞穿膜数量明显少于空白对照组、阴性对照组(p0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡实验结果显示:panc-1和miapaca-2早期凋亡率分别为26.93%3±1.74%、58.7%±4.4%,明显高于各自空白对照组或阴性对照组(p0.05)。流式细胞仪检测细胞周期发现panc-1和miapaca-2与各自空白对照组、阴性对照组dna比例无明显差异(p0.05)。在体内,敲减malat1抑制panc-1细胞的小鼠移植瘤生长。敲减malat1后,通过免疫印迹法检测相关通路蛋白,实验结果显示:miapaca-2细胞与阴性对照组相比,转录因子fos蛋白表达蛋白吸光度值下调49.4%,fgfr2的配体fgf2蛋白表达显著上调,cav1蛋白表达蛋白吸光度值上调310.1%?而panc-1细胞fos蛋白表达蛋白吸光度值下调30.6%,fgf2蛋白表达蛋白吸光度值上调67%;cav1蛋白表达上调蛋白吸光度值74%。其他egfr、itga6、vecfc、met和rap1等蛋白均无明显变化。以上结果提示:malat1可能通过调节fos/fgf2或cav1等基因的表达而调控pdac细胞的生长、侵袭、转移、凋亡等生物学功能。由于慢病毒介导malat1-shrna敲减malat1,后期出现malat1基因回调,导致malat1敲减率不稳定。因此,本研究应用crispr/cas9技术在直肠癌hct116wt二倍体细胞探索敲除和激活非常编码malat1体系。该技术是目前能克服其他转染方法(sirna、shrna)干扰效率较低、靶基因晚期上调、脱靶的效应及talen激活体系的缺陷。本研究首次构建dual-grnamalat1的敲除载体和dcas9-sgrna激活malat1的过表达载体,并成功构建携带malat1基因特异性crispr/cas9敲除和激活稳转株;dual-grna敲除malat1,敲除率达99%;dcas9sgrna激活malat1,malat水平增加500%-700%。同时,在体外实验结果显示:CRISPR/Cas9敲除MALAT1和激活MALAT1后,HCT116WT细胞增殖?克隆形成能力与对照组相比分别被抑制和增强(P0.05);CRISPR/Cas9敲除和激活MALAT1后,twist和snail mRNA的表达水平与对照组相比分别降低和增加(P0.05);MALAT1挽救实验显示:twist、snail的mRNA表达水平高于对照组相(P0.05)。最后经TNFa诱导MALAT1敲除HCT116WT细胞,敲除组MALAT1P65蛋白水平无变化,而对照组P65蛋白水平增高。这些提示敲除MALAT1后,可能致NF-kB通道失活和导致核内twsit?snail定位减少,从而抑制HCT116wt细胞增殖和迁移?总之,MALAT1在PDAC组织中和部分细胞高表达;其表达与肿瘤大小、浸润深度、肿瘤临床分期病情进展因素呈正相关;MALAT1表达与生存时间呈负相关;MALAT1有潜在作为病情评估的指标,是独立的预后因素。在体外,敲减MALAT1后,PDAC细胞增殖能力和克隆能力减弱;迁移、侵袭能力降低,抗凋亡能力减弱。在体内,敲减MALAT1,PANC-1细胞生长抑制。敲减MALAT1后,PDAC细胞中FOS蛋白表达水平下降和CVA1及FGR2的蛋白水平表达增加,由此推测:MALAT1可能通过调节FOS/FGF2或CAV1等基因的表达来激活ERK/MAPK信号通路,从而调控PDAC细胞生长?侵袭?迁移和凋亡。同时,成功构建dual-gRNA敲除和dCas9-sgRNA激活过表达MALAT1体系;CRISPR/Cas9技术将为为PDAC癌的基因研究和药物靶向治疗带来新的希望。
【图文】：

提示引物特异性好,无非特异性扩增（图 1引物扩增准确 随机取 qRT-PCR 扩增产内参基因的扩增片段与预期相符,分别为 ）, qRT-PCR 的产物唯一,无其他 DNA 污染

-1-2MALAT1 基因(上)和内参 GAPDH 基因(下)的 qRT-PCR 扩增和溶解 1-1-2The amplification carve melting point of MALAT1 and GAPDH in q图 1-1-3MALAT1(左)和 GAPDH(右)的扩增产物的电泳图re 1-1-3The electrophoretogram of MALAT1 and GAPDH amplification pLAT1 在
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9
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本文编号：2533950