ABT737通过影响线粒体动力学增加人胆管癌细胞对顺铂敏感性

发布时间：2019-09-16 07:12

【摘要】：胆管癌是除肝细胞癌最常见的肝胆系统恶性肿瘤，手术为其主要治疗方式，但仅适用于少数患者。胆管癌对化疗普遍不敏感。顺铂是目前临床指南推荐的胆管癌化疗药物，但天然或获得性耐药严重影响其疗效。研究胆管癌顺铂耐药机制具有重要意义。目前认为顺铂耐药机制主要包括药物浓度不足、DNA损伤修复异常和凋亡逃逸等。线粒体是顺铂的细胞内作用靶点之一，且线粒体凋亡途径是顺铂发挥抗肿瘤作用的主要途径之一。Bcl-2家族蛋白是通过调节细胞内抗凋亡家族成员与促凋亡家族成员的平衡影响线粒体外膜通透性形成，调节线粒体凋亡途径。在其他肿瘤中，Bcl-2家族蛋白已被证实与顺铂耐药机制密切相关。然而目前关于胆管癌顺铂耐药的机制研究较少。一些研究提示Bcl-2家族抗凋亡蛋白可能介导胆管癌耐受顺铂。 Bcl-2家族除调控线粒体外膜通透性外，也参与调节线粒体动力学。线粒体动力学主要指线粒体总量、线粒体间连接、线粒体亚细胞定位的动态变化,主要涉及线粒体分裂融合和线粒体自噬两个过程。目前认为线粒体动力学和细胞凋亡有关。线粒体通过分裂和融合产生短线粒体和长线粒体。线粒体分裂通常有利于哺乳动物中线粒体外膜通透性形成，而线粒体融合则会降低细胞对凋亡的敏感性。一些学者怀疑线粒体融合是顺铂耐药的潜在机制。目前公认线粒体分裂是线粒体自噬发生的前提。线粒体自噬是一种特殊形式的自噬。它在化疗耐药中的作用尚不明确。过度线粒体自噬可以导致细胞死亡。线粒体融合可抑制线粒体自噬发生，从而可能干扰线粒体自噬性细胞死亡。因此线粒体自噬也可能参与胆管癌顺铂耐药。本研究以人胆管癌细胞细胞株RBE为研究对象，以Bcl-2/Bcl-W/Bcl-xL抑制剂ABT737为工具，探讨Bcl-2家族及线粒体动力学在人胆管癌细胞顺铂耐药中的作用及机制，为胆管癌治疗提供新的治疗策略和方向。方法（1）细胞生存率由MTT法检测，Hoechst33342染色检测细胞核凋亡形态变化，细胞凋亡由Annexin V/PI染色后流式细胞术定量。DCFH-DA染色标识ROS变化，JC-1染色显示线粒体膜电势变化并由流式细胞术定量。（2）Western blot检测细胞总蛋白Bcl-2、Bak、Mcl-1蛋白水平。线粒体分离试剂盒获取线粒体和胞浆成分,并提取蛋白。Western blot检测胞浆蛋白细胞色素C、Bcl-2蛋白水平。（3）MitoTracker Red特异性标志线粒体，激光共聚焦观测线粒体形态，同时Hoechst33342标记细胞核。Western blot检测细胞总蛋白中分裂融合相关蛋白Mfn2、OPA1、Drp1、Fis1蛋白水平，线粒体蛋白及胞浆蛋白中Drp1蛋白水平。间接免疫荧光染色，激光共聚焦观察线粒体与Drp1共定位。（4）Western blot检测细胞总蛋白中p62和LC3蛋白水平。间接免疫荧光染色，激光共聚焦观察线粒体(MitoTracker Red)与p62、与LC3共定位。激光共聚焦观察LysoTracker Red（特异标记酸性细胞器）与MitoTracker Green（标记线粒体）共定位。（5）免疫荧光染色后激光共聚焦观察不同时间点细胞内p62表达及线粒体与p62共定位情况。（6）依据p62基因序列（GenBank：NM_003900），构建pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi重组质粒，命名为Si-p62，通过Western blot、荧光观察等技术验证。（7）检测RNAi p62后，细胞生存率由MTT法检测。Western blot检测细胞总蛋白中p62、Tom20、Drp1的表达水平。结果（1）ABT737合加顺铂能够有效地诱导人胆管癌细胞凋亡，而相同浓度顺铂只能致极少数细胞发生凋亡。联合用药能增加ROS蓄积、诱导线粒体膜电势的下降，，并诱导更多细胞色素C由线粒体向细胞浆释放。（2）与单加顺铂组相比， ABT737联合顺铂可明显增高Mcl-1(32kD)/Mcl-1(40kD)比例、Bak表达量并影响Bcl-2的线粒体定位。（3）顺铂能够诱导人胆管癌细胞线粒体融合。合加ABT737能够下调Mfn2、OPA1(120kD)表达，上调线粒体分裂蛋白Fis1水平，增加Drp1(60kD)/(80kD)比例，并可促进Drp1(60kD)向线粒体移位，线粒体主要以分裂形式存在，且线粒体分裂发生于凋亡之前。抑制线粒体分裂可部分减轻联合用药的杀伤作用。（4）单加顺铂和ABT737均能够轻度诱导人胆管癌细胞自噬活化，而联合用药能够明显强化自噬的活化。ABT737联合顺铂可以促进线粒体和p62、LC3、酸性细胞器的相互作用及并降低Tom20蛋白水平。RNAi p62后升高Tom20，同时提高人胆管癌细胞生存率。（5）ABT737联合顺铂作用时，p62聚集体在线粒体分裂为主细胞中明显多于以线粒体融合为主的细胞，同时RNAip62后，影响Drp1表达，特别是影响Drp1(60kD)/Drp1(80kD)比例。结论本研究以人胆管癌细胞株RBE作为研究对象，发现RBE细胞对顺铂敏感性差，而合加ABT737后可明显增加顺铂的杀伤作用。合加后发现ROS蓄积、线粒体膜电势下降，更多细胞色素C释放，提示顺铂对胆管癌杀伤作用差可能与线粒体损伤不足有关；进一步研究发现：合加组影响Bcl-2家族蛋白表达量及亚细胞定位，提示Bcl-2家族蛋白可能影响胆管癌对顺铂反应性。顺铂可明显诱导RBE细胞线粒体融合，而合加ABT737后可逆转为线粒体分裂，线粒体分裂早于凋亡发生，且抑制分裂能够提高细胞生存率，提示线粒体融合是胆管癌耐受顺铂的机制之一，同时干预融合可以逆转顺铂耐药；合加ABT737后自噬明显活化，且顺铂单加组线粒体自噬不明显，合加组线粒体自噬明显增多。抑制线粒体自噬后，细胞生存率提升。提示ABT737合加顺铂可能通过诱导过度线粒体自噬导致细胞死亡。基于以上结果，我们推测胆管癌的顺铂耐药与其线粒体动力学密切相关。 ABT737联合顺铂作用，p62聚集体在线粒体分裂为主的细胞中明显多于以线粒体融合为主的细胞，降低p62后，影响Drp1表达并影响线粒体自噬。提示p62可能通过影响线粒体动力学干预联合用药对人胆管癌细胞的杀伤作用。综上，我们以人胆管癌细胞系RBE作为研究对象，以Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-W抑制剂ABT737作为研究工具，证明胆管癌可能通过影响Bcl-2家族蛋白表达水平及定位、降低线粒体损伤、影响线粒体动力学来抵抗顺铂杀伤作用。ABT737能够干扰上述过程，增加胆管癌对顺铂的敏感性。可能为临床治疗胆管癌提供新的化疗方案。
【图文】：

外源性,线粒体,粒体,凋亡

图 1.1 线粒体凋亡途径及外源性凋亡途径体动力学与凋亡粒体分裂融合与凋亡线粒体分裂融合线粒体多被描述为扁豆样的细胞器均匀散落在细胞浆之中，体通常是呈条索状、相互交织甚至呈网状（networks）。线断变化之中，即通过调整线粒体分离和融合过程以产生较短]。研究者诱导由不同标签标记的线粒体膜发生融合，融合发可完成内部成分的充分混合[64]。进一步研究证明，在能量离子水平波动和有丝分裂等应激条件下，线粒体可以在短时

线粒体嵴,共同参与,转位,细胞色素C

1.3 线粒体分裂与线粒体嵴重构共同参与调控细胞色素 C 的释放左侧：在某些依赖于 Bax/Bak 的刺激下，Bax 转位于线粒体外膜，并在之后的线位点出寡聚化，最终导致线粒体内外膜间隙中的少量细胞色素 C 等释放入细rp1 亦可能参与这一过程）。MOMP 发生的同时，Drp1 可与释放出的因子 DDP/TIM作用，并重新募集至线粒体，诱导线粒体分裂，并导致 OPA1 的失能。最终导致的完全开放，释放出嵴内部之细胞色素 C；右侧：黑色箭头，当细胞色素 C 完全胞迅速死亡；红色箭头：当线粒体分裂被抑制后，线粒体嵴内的细胞色素 C 不释ase 激活受限，细胞存活时间延长。需要注意的是：尽管Drp1是目前公认调控线粒体分裂融合最主要的蛋白分裂仍是一种受多种蛋白调控的过程。Ishihara等在Drp1敲除小鼠的M，用放线菌素D仍可刺激线粒体分裂[81]。因此，需要观察其他线粒体分白的异常表达是否影响线粒体分裂和凋亡，以佐证二者之间的关系[84
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.8

【参考文献】