Fbxw7促进Slug降解抑制TGF-β诱导的肝癌转移

发布时间：2019-09-28 04:24

【摘要】：研究背景和目的:多年以来我国一直是原发性肝癌高发的国家,在临床上原发性肝癌也是常见的恶性肿瘤之一,全球每年50%以上的新发病例发生在我国。病理上,原发性肝癌可以分为肝细胞癌和胆管细胞癌,肝细胞癌是其中常见的病理类型,所占比例约为75%。虽然近年随着科技进步和研究的深入,我们获得了大量的新发现和新突破,但是原发性肝癌临床治疗后的长期生存率没有得到明显的提升,显示肝癌治疗研究的艰巨性和复杂性。Fbxw7(F-box and WD repeat domain-containing 7,FBW7)又称CDC4,是SCF型泛素连接酶的底物识别组成蛋白。Fbxw7能够通过特异性识别并结合被磷酸化的底物蛋白,从而使目的蛋白通过泛素蛋白酶系统降解。近来的研究发现,Fbxw7参与了许多重要信号通路节点蛋白的降解。Fbxw7是重要的抑癌基因,近年来不同的肿瘤临床及实验室研究发现,Fbxw7在维持肿瘤基因的稳定性、转移、侵袭、细胞分化、耐药中具有重要的作用。目前FBXW7与抑制肿瘤发生发展的机制及相关临床应用成为研究热点。本研究旨在研究Fbxw7在肝癌发生发展中的作用及机制。观察Fbxw7在肝癌中的表达情况以及其表达水平与临床预后的相关性;通过外源性差异表达Fbxw7细胞系,研究Fbxw7对肝癌细胞系的生物学行为的影响,并检测其细胞内信号通路的改变,深入了解Fbxw7对肝癌的调节作用。最后在体内进一步验证和了解Fbxw7对肝癌的作用。期望通过对Fbxw7的深入研究从而为临床应用转化提供重要的科研证据。研究方法:1.通过Real-Time PCR及Western blot方法在RNA及蛋白水平检测Fbxw7在肝脏癌和癌旁组织中以及不同肝癌细胞系中的表达情况;通过Real-Time PCR方法检测Fbxw7不同亚型在肝癌中的分布情况。2.利用组织芯片进行Fbxw7的组化染色,结合病人的预后及病理资料进行相关性分析。3.通过质粒转染联合抗性基因筛选,建立外源性过表达Fbxw7的细胞系,检测过表达Fbxw7对肝癌细胞增殖、克隆形成、转移、侵袭以及成球能力的影响。4.通过RNA干扰的方法,建立外源性干扰Fbxw7表达的细胞,观察其对肝癌细胞转移、侵袭能力的影响,反向验证Fbxw7对肝癌细胞的生物学功能的影响。5.通过皮下荷瘤模型以及尾静脉注射肺转移模型,在体内研究差异化表达Fbxw7的肝癌细胞的功能。6.通过Real-Time PCR方法检外源性差异表达Fbxw7后EMT相关基因的改变情况。7.利用不同炎症因子刺激,检测差异化表达Fbxw7对不同炎症信号通路的影响。8.通过Real-Time PCR及Western blot方法检测Fbxw7对TGF-β信号通路上游及下游的影响,另外通过转移、侵袭实验在体内验证其对细胞功能的影响。9.通过免疫共沉淀实验研究Fbxw7与Slug的相互作用情况,利用降解实验以及共转染实验研究Fbxw7对Slug降解的促进作用及方式;通过细胞免疫荧光实验研究Fbxw7与Slug共定位情况。实验结果:1.大多数病人肝癌组织中Fbxw7表达水平低于癌旁组织,而癌栓组织中Fbxw7表达水平极低,肝脏组织中Fbxw7α亚型表达最多。2.患者肝癌组织中的Fbxw7表达水平越高预后越好,呈现负相关,并且低表达的Fbxw7与患者的AFP、肿瘤包膜和TNM分级显著相关。3.肝癌细胞系中过表达Fbxw7能够减慢肝癌细胞的增殖,减少细胞克隆形成和成球数量,减少细胞的转移和侵袭数量。4.肝癌细胞系中干扰Fbxw7后,增加了肝癌细胞的增殖,增加了细胞的转移和侵袭数量。5.过表达Fbxw7能减小肝癌细胞体内荷瘤的体积以及重量,并且能够明显减少肝癌细胞肺转移的数量。6.过表达Fbxw7能减弱炎症信号通路的反应,降低EMT相关基因的表达。7.Fbxw7能够通过抑制TGF-β信号通路上下游,进而影响肝癌细胞的转移和侵袭能力。8.Fbxw7能够通过降解Slug从另一方面抑制肝癌细胞转移和侵袭。实验结论:本研究通过外源性差异化表达Fbxw7在体内和体外研究发现,Fbxw7能够负向调节肝癌细胞的增殖、克隆形成、转移、侵袭和成球能力;Fbxw7通过对TGF-β信号通路的上下游的负向调控以及促进Slug的降解,参与调节肝癌细胞的转移和侵袭。此外,Fbxw7的表达水平与病人的术后生存及临床预后负相关,提示其可以成为肝癌预后的一个因素。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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