转录调节因子NUPR1调控非小细胞肺癌自噬溶酶体途径的机制

发布时间：2019-10-02 10:06

【摘要】：目的:NUPR1是转录调节因子,应激条件诱导其表达增加并参与细胞增殖和细胞周期等重要过程。以往研究发现,NUPR1参与肿瘤的发生发展调控。NUPR1能够促进乳腺癌细胞的内质网应激、神经胶质瘤细胞的增殖、胰腺癌细胞的恶性进展等重要过程。另外,NUPR1还参与诱导癌细胞的早熟性衰老与凋亡,对癌症的发展具有抑制作用。在癌症患者中,自噬被认为通过调节肿瘤细胞内环境稳态参与肿瘤发展。然而,自噬的调控机制尚属未知。NUPR1能够参与自噬的调节已有报道。目前,NUPR1对肺癌的自噬研究少有报道。通过该项研究,在非小细胞肺癌细中探索NUPR1对肺癌患者生存期的关联,求证NUPR1对自噬进程的调控机制,以期对肺癌的发生发展有更充分地认识,为肺癌的靶向治疗提供理论基础。方法:本研究分为三部分。第一部分研究NUPR1在肺癌患者的表达情况;第二部分探索改变NUPR1表达后,肺癌细胞产生的生命活动变化;第三部分研究NUPR1对肺癌细胞的转录调控机制。第一部分:通过免疫组织化学染色分析肺癌患者组织芯片中NUPR1的表达水平,统计分析NUPR1与肺癌患者生存期之间的关联。利用RT-PCR与Western blot实验检测正常人支气管上皮细胞系与多种肺癌细胞中NUPR1的表达水平。第二部分:利用慢病毒介导的RNA干扰技术在肺癌细胞系中下调NUPR1的表达,通过光学显微镜观察肺癌细胞的形态学改变,利用中性红染色、吖啶橙染色、Lyso-Tracker Red染色对下调NUPR1表达的肺癌细胞所发生的形态改变进行分析,通过Western blot检测相关途径的蛋白分子标记物的表达水平差异,然后进行Brd U细胞增殖实验、流式细胞仪细胞周期检测实验、软琼脂克隆形成能力实验、小鼠皮下注射成瘤等实验,对下调NUPR1表达的肺癌细胞所发生的生物学功能改变进行检测。第三部分:下调NUPR1的肺癌细胞提取总RNA,与对照组细胞进行转录组对比分析,验证差异表达基因。通过Ch IP实验、荧光素酶报告基因实验证实NUPR1的直接调控基因SNAP25,然后下调SNAP25检测细胞功能改变并通过过表达SNAP25进行细胞功能恢复实验。通过免疫沉淀质谱分析鉴定SNAP25在维持肺癌细胞自噬功能过程中的共同作用蛋白。结果:第一部分研究结果显示:在肺癌细胞系中NUPR1的蛋白表达水平显著高于正常人肺支气管上皮细胞系NHBE;对肺癌组织芯片进行免疫组织化学染色(IHC)分析,IHC染色结果显示,组织芯片中118例肺癌组织中NUPR1蛋白在患者肺癌组织中高表达,22例癌旁对照组织中NUPR1蛋白低表达;NUPR1低表达的肺癌患者生存期明显优于高表达NUPR1的肺癌患者(P0.01)。第二部分研究结果显示:下调NUPR1后的A549细胞内出现大量囊泡,随着时间推移实验组细胞大量死亡;中性红染色、吖啶橙染色、Lyso-Tracker Red染色均为阳性,下调NUPR1诱导肺癌细胞产生的囊泡为酸性结构;下调NUPR1诱导肺癌细胞自噬溶酶体外排释放功能受损,导致自噬溶酶体的体积增大形成囊泡,并且囊泡在自噬缺陷的肺癌细胞中无法形成;下调NUPR1诱导肺癌细胞早熟性衰老,削弱肺癌细胞增殖能力和成克隆能力。第三部分研究结果显示:下调NUPR1的A549细胞与对照组细胞进行转录组测序对比,自噬和溶酶体途径的诸多基因转录改变,例如ATG9B、LCN2、TPPP3、SNAP25和SQSTM1等;下调SNAP25诱导肺癌细胞产生的囊泡,诱导肺癌细胞早熟性衰老,削弱肺癌细胞增殖能力;过表达SNAP25可部分消除NUPR1缺失引起的囊泡,进而证实SNAP25是NUPR1的直接操控基因。
【图文】：

天津医科大学博士学位论文一、NUPR1 在肺癌的表达1.2 结果1.2.1 NUPR1 在肺癌组织中高表达为了探索 NUPR1 对肺癌的影响，本研究首先选取正常人肺支气管上皮细胞系 NHBE 与多种肺癌细胞系作为研究对象，提取对数期生长的细胞总 RNA，，经逆转录反应得到各细胞系的 cDNA，通过 RT-PCR 实验检测 NUPR1 转录表达差异；选取以上细胞系对数期生长的细胞收取全细胞裂解液，通过蛋白质印迹（Western blot）实验检测 NUPR1 的蛋白表达差异。

肺癌细胞

图 2.1 下调 NUPR1 诱导肺癌细胞产生囊泡。A，RT-PCR 检测 shRNA下调 NUPR1的效率，GAPDH为内参基因，*P < 0.01。B，Western blot检测shRNA下调NUPR1的效率，GAPDH 为内参照。C，倒置光学显微镜观察下调 NUPR1 诱导的肺癌细胞形态改变，比例尺 10 μm。2.2.2 下调 NUPR1 诱导肺癌细胞产生的囊泡是细胞内的酸性结构为了证实我们所提出的假设，我们需要对下调 NUPR1 诱导肺癌细胞产生的囊泡做进一步研究，确认所产生囊泡的属性。首先，我们选取中性红（Neutral red）作为染料，中性红是一种水溶性染料，分子量为 288，能够穿过活细胞膜并结合在细胞质的酸性膜结构内部，活细胞不能摄取染料，因此，染色红色为染色阳性结果。将中性红染色法用于真核细胞染色研究细胞内部结构已有文献报道[24,25]。本研究中应用中性红染色测定下调 NUPR1 诱导肺癌细胞产生的囊泡属性，结果表明：下调 NUPR1 诱导肺癌细胞产生的囊泡是中性红染色阳性的结构（图2.2A），属于细胞质中的酸性结构。然后，选择吖啶橙（acridine orange，AO）作为鉴定囊泡属性的第二种染色方法，吖啶橙是一种荧光染色试剂，能通过细
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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