Metformin增强口腔鳞癌对顺铂化疗敏感性的实验研究

发布时间：2019-10-15 13:13

【摘要】：研究背景化疗耐药在口腔恶性肿瘤的临床治疗中较为常见,也是导致患者治疗失败、预后较差的重要原因之一。近年来,已有大量研究发现肿瘤低氧微环境中低氧诱导因子1α(HIF-1α)的存在可以导致肿瘤化疗耐药。此外肿瘤微环境另一特征是慢性炎症,而核因子κB(NF-κB)作为炎症应答中的重要转录因子,已被证实与HIF-1α之间存在交互调控效应。我们的前期研究以及部分研究者已发现NF-κB位于HIF-1α启动子的上游,具有调控HIF-1α转录的功能。二甲双胍(Metformin)作为广泛应用的降血糖药物,同时众多的研究者发现其对多种肿瘤发挥抗肿瘤作用,但是其中抗肿瘤的机制并不十分清楚。本研究中我们分别通过体内及体外实验去探究二甲双胍联合化疗药物顺铂治疗口腔鳞癌的效果及可能机制,为口腔肿瘤的临床治疗提供更多可能。研究目的探究Metformin能否通过NF-κB/HIF-1α增强口腔鳞癌对顺铂的化疗敏感性。研究方法1.将顺铂以浓度梯度稀释后处理口腔鳞癌细胞系HSC3、SCC3、TCA8113,分别在常氧和低氧条件下培养48h,应用MTT检测口腔鳞癌细胞系对顺铂治疗的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50);2.分别将三种口腔鳞癌细胞系在低氧和常氧条件下培养48h后,通过western blot方法检测三种口腔鳞癌细胞系中HIF-1α表达情况,再应用干扰RNA技术抑制HIF-1α表达后,通过MTT法检测口腔鳞癌细胞对于顺铂治疗的IC50值;3.联合应用Metformin和顺铂处理三种口腔鳞癌细胞系,分别在常氧和低氧条件下培养48h后收集细胞,通过流式方法检测肿瘤细胞在常氧和低氧培养下细胞的凋亡变化情况;4.应用metformin处理三种口腔鳞癌细胞系,分别在常氧和低氧条件下培养24后,通过免疫荧光方法检测Metformin对HIF-1α和NF-κB亚基p65表达及核转位的作用;5.动物实验:饲养裸鼠共16只,分4组,每组4只。应用口腔鳞癌细胞系HSC3建立裸鼠移植瘤模型,4组裸鼠依次采用Metformin、cisplatin、Metformin+ cisplatin方法处理,最后处死裸鼠,收集瘤体组织,免疫组化检测NF-κB/HIF-1α蛋白表达变化,TUNEL方法检测肿瘤细胞凋亡情况。研究结果1.应用顺铂处理三种口腔鳞癌细胞系HSC3、SCC3、TCA8113,低氧和常氧条件下培养48h后,结果显示.IC50值在低氧条件下显著高于常氧状态;2.低氧条件下培养口腔鳞癌细胞48h后,western blot方法检测显示三种细胞HIF-1α表达均明显升高,采用siRNA干扰技术抑制HIF-1α表达后,口腔鳞癌细胞对顺铂的IC50值较对照组均降低;3.联合应用Metformin和顺铂处理三种口腔鳞癌细胞系,分别在常氧和低氧条件下培养48h后收集细胞,流式细胞术方法检测结果显示三种口腔鳞癌细胞在低氧培养条件下的凋亡比例较单纯顺铂处理组明显升高;4.分别在常氧和低氧条件下采用Metformin处理肿瘤细胞后可以明显抑制HIF-1α和p65核转位变化;5.裸鼠体内实验中,联合应用Metformin和顺铂处理裸鼠后可以显著抑制HIF-1α,GLUT-1,Bcl-2,p-p65表达,并且肿瘤细胞的凋亡比例显著增加,即显示了Metformin增强顺铂的治疗作用。研究结论在低氧条件下Metformin可以通过抑制NF-κB/HIF-1α信号增强口腔鳞癌细胞对顺铂化疗的敏感性,有望成为临床上靶向治疗的新途径。
【图文】：

＊；邋ＰＣ０．０１＊＊邋；邋ＰＣ０．００１料＊0逡逑４实验结果逡逑４．１邋口腔鳞癌低氧微环境对顺铀化疗敏感性的研宄逡逑ＯＳＣＣ细胞系ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、ＴＣＡ８１１３分别在常氧（２０％0２）和低氧（１２）环境下培养４８ｈ后测定半数抑制浓度．从结果可见三种细胞系低氧培养后５０均显著高于对照组即常氧培养组（ＴＣＡ８１１３：邋ｐ＜０．０１，邋ＨＳＣ３、ＳＣＣ３邋：ｐ＜０．００１）鳞癌细胞系ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、ＴＣＡ８１１３的ＩＣ５值。逦（单位：ｐＭ对照组（常氧）逦ｐ0２ｌ％逡逑１１．２６±０．９１逦１７．４４士１．１０逡逑５．７３±０．４２逦９．８６±１．５５逡逑３逦７．５４±０．８８逦９．８３±１．３０逡逑

培养４８ｈ，提取各组细胞培养后的ｍＲＮＡ及蛋白，分别使用ｑ－ＰＣＲ与Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑方法检测低氧环境下ＨＩＦ－ｌａ表达情况。结果发现转染ｓｉ－ＨＩＦ－ｌａ后ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、逡逑ＴＣＡ８１１３细胞在低氧条件下，，ｍＲＮＡ水平明显降低（图２Ａ），并且其ＨＩＦ－ｌｃｔ逡逑蛋白水平明显降低（图２Ｂ）。逡逑Ｉ逦灥邋ＯＣＴＲＯＩ逡逑ｍ逦＾逦＾逦＿贫躺。逡逑Ｉ邋１0｜邋ｆｌ逦，丨■逡逑ｈ：！ｂ逡逑＾逡逑＃逦＃逦＾逡逑Ｂ逦ＨＳＣ３逦ＳＣＣ３邋ＴＣＡ８１１３逡逑ＮＣ邋ｓｉＲＮＡ邋ＮＣ邋ｓｉＳＭＡ邋ＭＣ邋ｓｉＲＮＡ逡逑…ｗ邋“逡逑ｐ－８Ｃｌｉｆｌ邋？ＭＢＭａａｒ邋ｎｍｍｍｉｍｉｍ－逡逑图２示：将ｓｉ－ＨＩＦ－１邋ａ转染口腔鳞癌细胞４８ｈ后置于１邋％０２和常氧条件下培养４８ｈ，逡逑通过ｑＰＣＲ与Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法检测细胞ＨＩＦ－ｌｏｔ表达情况。Ａ图示ｑＰＣＲ结果；逡逑Ｂ图为ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ结果。逡逑１．４．３邋ＨＩＦ－ｌｃｔ在低氧微环境中对ＯＳＣＣ顺铂化疗敏感性的影响逡逑为了探究ＨＩＦ－ｌｏ（在ＯＳＣＣ细胞适应低氧微环境中所起到作用，我们将低表逡逑达ＨＩＦ－ｌａ的ＯＳＣＣ细胞系ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、ＴＣＡ８１１３接种至９６孔板中，放于含逡逑１％0２的培养箱中培养４８ｈ后，通过ＭＴＴ方法检测ＯＳＣＣ细胞系的ＩＣ５0值。结逡逑果显示正常细胞组ＨＳＣ３、ＳＣＣ３、ＴＣＡ８１１３的ＩＣ５Ｄ值明显高于ＨＩＦ－ｌａ低表达组逡逑肿瘤细胞的ＩＣ５0值（Ｐ＜０．０５）。同时我们通过ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法测定了邋ＨＩＦ－１的耙基逡逑因Ｂｃｌ－２、ＧＬＵＴ－１及ＨＩＦ－ｌａ本身的蛋白表达改变情况。结果提示在
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.8


本文编号：2549650