全反式维甲酸诱导分化肝癌干细胞作用研究

发布时间：2019-10-15 18:35

【摘要】：第一部分肝癌干细胞的检测、分离纯化、培养和鉴定目的：检测不同肝癌细胞株的肿瘤干细胞标记物表达水平,选取高表达细胞株分离标记物阳性细胞进行培养,并对培养的阳性细胞进行干细胞鉴定。方法：CD133作为常用的肝癌干细胞标记物,用CD133磁珠抗体孵育并结合表达其抗原的肝癌细胞,运用磁珠分选技术分离纯化阳性细胞。分离纯化后的肝癌干细胞用含有高生长因子的干细胞培养基培养以维持其干细胞特性,抑制分化。比较CD133抗原阴性和阳性的肝癌细胞,其表达胚胎干细胞标记物的水平,包括SOX2、OCT4和NANOG。结果：流式细胞技术检测肝癌细胞株HepG2、Huh-7和PLC-PRF-5表达CD133的细胞比例分别为10.8%、0.176%和0.07%。选取HepG2细胞进行CD133阳性细胞磁珠分选,培养于含高生长因子的培养基。对分选出的CD133-和CD133+HepG2细胞,提取蛋白进行蛋白免疫印迹分析(Western Blot),显示胚胎干细胞标记物在CD133+ HepG2细胞中高表达。结论：肝癌细胞HepG2有CD133抗原表达,此类细胞高表达胚胎干细胞标记物,指示CD133阳性的HepG2细胞具有肿瘤干细胞特性。第二部分全反式维甲酸分化肝癌干细胞目的：分离纯化肝癌细胞HepG2中的肿瘤干细胞(CD133＋),检测全反式维甲酸(ATRA)对肝癌干细胞的分化效果。方法：肝癌细胞HepG2在10%胎牛血清中培养,用肿瘤干细胞标记物CD133的磁珠抗体分离纯化出肝癌干细胞(HepG2/CD133+),培养于含高浓度生长因子(20 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF2和B27)的无血清DMEM/F12培养基,以维持干细胞特性。全反式维甲酸(ATRA)以不同浓度(10-9～10-5M)加入到干细胞培养基,在不同培养时间检测肿瘤干细胞标记物CD133和胚胎干细胞标记物SOX2、OCT4、NANOG的表达。结果：肝癌干细胞(HepG2/CD133+)在ATRA处理12小时和24小时后,细胞流式分析显示细胞表面的CD133抗原表达降低,蛋白免疫印迹分析(Western blot)也表明肿瘤干细胞标记物CD133蛋白表达减少。同时,肝癌干细胞(HepG2/CD133+)在含不同浓度ATRA的干细胞培养基中培养5天后,胚胎干细胞标记物SOX2、OCT4、NANOG蛋白表达在ATRA浓度升高时蛋自水平显著降低。结论：肝癌干细胞(HepG2/CD133+)在全反式维甲酸处理后,干细胞特性显著降低。第三部分临床肝癌组织中的维甲酸代谢目的：肝是人体合成维甲酸的器官,而全反式维甲酸是常见的抗癌药,在白血病中通过分化癌变造血干细胞,最终使之凋亡。研究肝癌组织中维甲酸代谢,将有助于研究肝癌发生、发展,以及肝癌干细胞抗分化机制。方法：通过临床数据库Oncomine database,分析在肝癌病人组织中参与由视黄醇合成视黄醛,再由视黄醛脱氢合成维甲酸过程中脱氢酶的表达和活性,并和正常组织和其他类型肿瘤组织进行比较,研究肝癌组织中维甲酸的代谢特点。结合临床肝癌病人的免疫组织化学(IHC)分析,检测肝癌组织中与维甲酸合成有关的乙醇脱氢酶、视黄醇脱氢酶和视黄醛脱氢酶表达,反应维甲酸合成信号活性。结果：通过分析Oncomine database数据库1911例16种不同癌症病人的组织样本,(其中膀胱癌32例、脑癌和中枢神经系统癌症4例、乳腺癌328例、宫颈癌35例、结直肠癌330例、食道癌328例、胃癌7例、头颈癌41例、肾癌254例、肝癌11例、肺癌107例、淋巴瘤19例、口癌166例、胰腺癌19例、前列腺癌59例、恶性毒瘤49例),发现维甲酸合成所需的合成酶系统,包括乙醇脱氢酶(ADH1)、视黄醇脱氢酶(RDH10)和视黄醛脱氢酶(RALDH1)的mRNA在肝癌组织中的表达最高。在蛋白水平,分析了各3例肝癌组织样本和正常肝组织样本,检测到乙醇脱氢酶(ADH1)、视黄醇脱氢酶(RDH10)和视黄醛脱氢酶(RALDH1)在肝癌组织中都有表达,尤其视黄醇脱氢酶(RDH10)的表达最高。结论：维甲酸合成所需的酶系统(ADH1、RDH10、RALDH1)、mRNA在肝癌组织的表达高于其他15种癌症组织,免疫组织化学分析也检测到这些酶在肝癌组织中的蛋白表达。第四部分全反式维甲酸增加肝癌干细胞对抗癌药物的敏感性目的：在肝癌以及其他癌症治疗中,对抗肿瘤药物治疗的耐药性和肿瘤术后复发是两大难题。经过长期的基础和临床研究发现,肿瘤中含有对肿瘤的发生、生长和转移起到关键作用的一个细胞群,该类细胞高表达胚胎干细胞标记物。寻找降低该类细胞的干细胞特性、增加对抗癌药物敏感性的方法,将为肿瘤治疗提供新的治疗思路和途径。方法：全反式维甲酸(ATRA)以不同浓度(10-7、10-6、10-5M)处理肝癌干细胞HepG2/CD133+后,用抗癌药物多烯紫杉醇(Docetaxel, DOC)进行杀伤,并和DOC单独处理组进行比较,检测细胞增殖活性和细胞凋亡的变化和对裸鼠成瘤性的影响。结果：全反式维甲酸分别以10-7、10石、10-5M浓度处理HepG2/CD133+细胞5天,细胞的增殖活性没有降低,在浓度最高组(10-5M)的增殖活性还略有升高(120%)。多烯紫杉醇分别以10-10、10-9、10-8M浓度处理HepG2/CD133+细胞5天,细胞增殖活性随着多烯紫杉醇的浓度升高而分别降低至85%、70%、55%。结合全反式维甲酸和多烯紫杉醇,ATRA在10-7、10-6、10-5M浓度配合DOC(10-9M)对肝癌干细胞HepG2/CD133+进行杀伤,发现药物配合组比多烯紫杉醇单独处理组的细胞组织活性出现显著降低(P0.01)。用染料PI和Annexin V对细胞凋亡情况进行检测,发生晚期凋亡的细胞比例明显升高。DMSO对照组细胞、ATRA和DOC单独处理组细胞、以及ATRA联合DOC处理后细胞,皮下注射到裸鼠进行成瘤性实验,结果发现第55天对照组的肿瘤体积为400.00mm3, ATRA和DOC单独处理的肝癌干细胞成瘤性并未没有出现显著变化,肿瘤体积分别为321.73 mm3和150.59 mm3,而ATRA联合DOC处理后的肝癌干细胞成瘤性受到很大抑制,仅为22.93 mm3。结论：全反式维甲酸分化肝癌干细胞HepG2/CD133+后,对抗癌药物多烯紫杉醇敏感性升高；ATRA和DOC药物的配合使用增加了对肝癌干细胞HepG2/CD133+的杀伤效果,使肝癌细胞发生凋亡,裸鼠成瘤性降低。第五部分β-catenin信号介导全反式维甲酸分化肝癌干细胞目的：全反式维甲酸分化肝癌干细胞HepG2/CD133+,研究其分化的分子机制,将为分化和治疗肝癌干细胞寻找出多种药物靶点,为临床应用提供切实有效途径。方法：PI3K/AKT通路和β-catenin蛋白在细胞增殖、细胞活性、肿瘤发生和发展、胚胎干细胞分化发育中有重要作用,研究在全反式维甲酸分化肝癌干细胞HepG2/CD133+过程中,其蛋白信号的变化情况。通过对β-catenin蛋白表达进行干扰调节,进一步证实PI3K/AKT通路和β-catenin蛋白全反式维甲酸诱导的肝癌干细胞分化的作用机制。结果：全反式维甲酸分别以10-7、10-6、10-5M浓度处理HepG2/CD133+细胞5天,PI3K蛋白表达和AKT磷酸化水平显著降低；β-catenin蛋白水平降低,磷酸化水平升高,mRNA水平没有发生明显变化,说明β-catenin通过磷酸化途径被降解。而PI3K/AKT信号负责与GSK3β蛋白结合,阻止GSK3β降解β-catenin,全反式维甲酸抑制PI3K/AKT信号后,GSK3β蛋白被释放,使β-catenin蛋白受到降解。结论：全反式维甲酸通过抑制PI3K/AKT信号,释放GSK3P蛋白,降解β-catenin,诱导分化肝癌干细胞HepG2/CD133+。
【图文】：

肝癌细胞株,生长情况

逑中的生长情况逡逑Ｈ种肝癌细胞株在ＤＭＥＭ邋（含１０％ＦＢＳ）中呈贴壁性生长（图１）逡逑邮０２逦Ｈｕｈ－７逦ＰＬＣ／ＰＲＦ－５逡逑画画S/逡逑图１：兰种肝癌细胞株在ＤＭＥＭ中的生长情况（１０倍）逡逑Ｉ＾ｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｈｒｅｅ邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉ打ｅｓ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｉｎ邋ＤＭＥＭ邋ｍｅｄｕｉｎ邋（邋１０邋ｆｏｌｄ）逡逑２肿瘤干细胞标记物ＣＤ１３３在Ｈ种不同肝癌细胞株中的表达逡逑Ｈ个细胞株用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基陪１４天Ｗ后，，用化２５％的族酶消逡逑化至单个细胞，在４°Ｃ用Ｆ打Ｃ标记的ＣＤ１３３抗体（ＦＩＣＴ／ＣＤ１３３）艇育１０分钟逡逑后进行细胞流式分析。黑色线条是抗体的ＩｇＧ同型对照（Ｉｓｏｔｙｐｅ），结果显示Ｈ逡逑株细胞的ＣＤ１３３抗原含量差异较大，有ＣＤ１３３抗原表达（蓝色）的ＨｅｐＧ２细逡逑胞为１０．８％，Ｈｕｈ－７细胞为０．１６７％，ＰＬＣ－Ｐ民Ｆ－５为０．０７％，ＨｅｐＧ２细胞的表达率逡逑最高（图２）。本课题挑选ＣＤＤ３＋细胞高达１０．８％的Ｈ巧Ｇ２细胞进行实验，Ｗ保逡逑证实验的可操作性。逡逑Ｈ邋巧邋Ｇ２逦Ｈｕｈ－７逦ＰＬＣ－ＰＲＦ－５逡逑—逦７邋三邋ｃｍ呵逦—ＣＤ１３３逦＾邋ＣＤ＂３逡逑ｆ邋１逡逑Ｉ邋Ｉ邋＼ｌ０．８％逦Ｉ邋ｋｌ６７％逦０．０７％逡逑０邋一邋邋＇羞’邋＇ｌｌ＂，邋邋Ｉ逦■ｎｊ￣？逦－逡逑０邋１0４逦１０？逦１０？逦１0７逦０邋１０＊逦１０＊逦１０＊逦１0７逦０邋ｌＯ＊邋１０？逦１０＊逦１０

肿瘤细胞,培养基,分离纯化,情况

－肿瘤细胞在含有１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基中呈贴壁细胞性逡逑生长（图４）逡逑ＣＤ１３３邋ｎｏｎ－ｈＣＳＣｓ逡逑葬逡逑图４ＣＤ１３３－肿瘤细胞在ＤＭＥＭ邋（含１０％ＦＢＳ）培养基中生长的情况逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４邋ＣＤ邋１３３—邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｃｅ化邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｉｎ邋ＤＭＥＭ邋ｍｅ出ｕｍ邋ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋１０＊Ｘ＞邋ＦＢＳ逡逑４．２分离纯化后Ｈ巧Ｇ２／ＣＤ１３３＋肿瘤干细胞在干细胞培养液中生长情况逡逑分离纯化后Ｈ巧Ｇ２／ＣＤ１３３＋肿瘤干细胞经过５天培养，在干细胞培养液中逡逑３２逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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