PGAM1在mTOR诱导肿瘤有氧糖酵解中的作用及机制研究

发布时间：2019-11-10 08:18

【摘要】：糖代谢异常被认为是肿瘤的重要特征之一。上世纪20年代德国科学家Otto Warburg首先发现肿瘤细胞无论氧气充足与否,均选择进行产能效率较低的糖酵解途径,葡萄糖消耗、糖酵解速率以及乳酸生成均较正常细胞明显增加,因此称为“Warburg效应”或“有氧糖酵解”。然而,肿瘤细胞为什么会发生糖酵解,其在肿瘤发生中的作用及机制等,仍有待于进一步研究。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)通路活化是肿瘤中最常见的信号通路异常。该通路中的抑癌基因如结节性硬化复合体1/2(Tuberous sclerosis complex 1/2,TSC1/2)和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的失活均可以导致mTOR通路过度活化,从而促进肿瘤发生。我们的前期研究表明,mTOR通路活化能够促进Warburg效应的发生。磷酸甘油酸变位酶1(Phosphoglycerate mutase 1,PGAM1)是糖酵解途径中重要的催化酶之一,在多种肿瘤组织中有高表达,且与糖代谢调节有关。然而,其在肿瘤中的作用及调节机制并不是很清楚。为探讨PGAM1在肿瘤细胞中表达上调的可能机制,以及PGAM1在mTOR通路活化导致的有氧糖酵解和肿瘤发生发展中的作用,本课题研究分为以下三个部分:第一部分,利用Tsc2和Pten敲除导致mTOR通路活化的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)与野生型MEF进行比较,观察PGAM1的表达及酶活性变化,并加入mTOR抑制剂雷帕霉素进行进一步验证。ELT3是Tsc2缺失的细胞系,其mTOR通路也是活化的,我们通过使用雷帕霉素处理或在ELT3中转入TSC2来抑制mTOR通路,进一步观察PGAM1表达与酶活性的变化。此外,我们在Tsc2杂合小鼠肾脏肿瘤与野生型小鼠肾脏组织中比较了PGAM1的表达。同时,我们在人肺癌组织及癌旁组织中观察PGAM1的表达。最后,在Tsc2-/-、Pten-/-MEF中稳定敲低缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor1α,HIF1α)来检测mTOR是否通过HIF1α来调节PGAM1表达,并通过染色质免疫共沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)验证HIF1α对PGAM1的表达调控。结果显示:PGAM1的蛋白表达和酶活性在mTOR通路活化的MEF中升高。ELT3细胞中恢复TSC2表达或加入雷帕霉素可以降低PGAM1的表达和酶活性。PGAM1蛋白的上调也存在于Tsc2杂合小鼠的肾脏肿瘤组织和人肺癌组织。mTOR通路活化MEF中敲低HIF1α可下调PGAM1表达,ChIP进一步证明了mTOR通路通过HIF1α介导的转录激活来上调PGAM1的表达。第二部分,利用RNA干扰技术在Tsc2-/-和Pten-/-MEF中敲低PGAM1,观察细胞葡萄糖消耗和乳酸生成,即Warburg效应的变化。同时利用细胞增殖实验和克隆形成实验,观察PGAM1敲低后对细胞增殖能力和克隆形成能力的影响。将Pten-/-PGAM1敲低的MEF与对照MEF接种裸鼠,观察两组裸鼠的无瘤生存期和总生存期。结果显示:PGAM1蛋白表达下降可以降低mTOR通路活化导致的Warburg效应,并且下调了细胞增殖能力和克隆形成能力。接种PGAM1敲低的Pten-/-MEF裸鼠无瘤生存期和总生存期均长于对照组裸鼠,说明PGAM1在肿瘤形成及生长过程中起着重要作用。第三部分,收集天津医科大学肿瘤医院非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)术后癌组织与癌旁组织28对,检测其PGAM1信使RNA(message RNA,mRNA)表达的不同。收集天津医科大学肿瘤医院227例NSCLC和30例结直肠癌术后石蜡组织标本,应用免疫组织化学法检测标本中PGAM1和磷酸化核糖体蛋白S6(Phospho-ribosomal protein S6,pS6)表达,分析两者之间的相关性及其与患者预后的关系。结果显示:在NSCLC中,癌组织PGAM1的表达高于癌旁组织。在NSCLC与结直肠癌中,PGAM1高表达的患者总生存期(Overall survival,OS)和无进展生存期(Progression free survival,PFS)均较低表达的患者差,且PGAM1表达与mTOR通路活化具有显著相关性。综上所述,得出以下结论:1)mTOR信号通路活化上调糖酵解酶PGAM1表达及其酶活性,HIF1α介导了mTOR通路对PGAM1表达的调节。2)PGAM1的表达水平影响肿瘤有氧糖酵解,增殖,克隆和成瘤能力。3)NSCLC肿瘤组织PGAM1表达升高。NSCLC与结直肠癌中,PGAM1高表达与患者预后不良相关,且PGAM1表达与mTOR通路活化具有显著相关性。
【图文】：

图 1.1 pLL3.7 载体质粒结构图应下双酶切反应体系表 1.2 双酶切反应体系（20μl）试剂 体积 试剂 体积IF1α 序列模板 4μl pLL3.7 质粒 4μHpaI 1μl HpaI 1μXhoI 1μl XhoI 1μ10×Buffer 2μl 10×Buffer 2μ去离子水 12μl 去离子水 12μ系分别混匀，低速离心后，置于 37℃水浴中 2 小时;反应体系

学博士学位论文 一、mTOR 通路对 PGAM1 表达的调控M1 蛋白表达和酶活性在 mTOR 通路活化的 MEF 中上调的主要工具是基因敲除的 MEF 和野生型 MEF，理论依据en 的敲除会导致 mTOR 信号通路的过度活化，以此为基础应-actin，TSC2/PTEN，S6，pS6，和 PGAM1 的蛋白表达水平。其TSC2/PTEN 用来检验基因敲除效果，pS6 作为 mTOR 通并以总 S6 为参照。结果证明，Tsc2 和 Pten 敲除 MEF 中生型 MEF，，用雷帕霉素处理之后 pS6 表达水平明显下降除 MEF 是 mTOR 通路活化的。我们进一步发现，与野生型路过度活化 MEF 中 PGAM1 的表达明显升高，加入雷达明显减少，说明 PGAM1 的表达受到 mTOR 调控（图 1
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2

【共引文献】

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本文编号：2558780