长链非编码RNA在肝癌术后复发中的意义及机制研究

发布时间：2019-11-11 10:50

【摘要】：原发性肝癌(简称肝癌,Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见恶性肿瘤,近年来在世界范围内发病率呈现上升趋势,给社会经济带来沉重负担。手术切除是其主要治疗手段,但是手术后肿瘤的高复发率严重影响了治疗效果,研究预测肿瘤手术切除后复发,是提高肝癌临床疗效,改善患者预后及生存质量亟待解决的重大科学问题。随着二代测序技术和生物信息分析技术的进展,发现越来越多的长链非编码RNA在肿瘤发生发展中发挥着重要作用,是目前研究的最前沿领域,是新的肿瘤标志物和药物靶标的重要来源。因为长链非编码RNA对肿瘤的调控处于基因的上游阶段,受干扰较少,研究其对肝癌的预后影响及机制,能够为肝癌临床诊断与治疗提供了新的研究策略。第一部分:肝细胞肝癌组织和癌旁组织中差异表达的长链非编码RNA的筛选与功能学验证研究目的:筛选出在肝癌组织和癌旁组织中差异表达的长链非编码RNA并在组织学和细胞系中验证其差异表达能力,选取进一步研究的目标RNA。研究方法:利用二代测序技术和生物信息学分析方法筛选肝切除术后肝癌组织和癌旁组织中差异表达的长链非编码RNA,并进一步在正常肝细胞系、肝癌细胞系中验证其表达能力。研究结果:利用构建的肝癌基因芯片同时检测肝癌组织和癌旁组织中长链非编码RNA和信使RNA的表达量,筛选出差异性表达的LncRNA632条和mRNA391条,其中7条 LncRNA (p2609/p33560/ p3816/p40127-v4/p22534/p8751/p42540-v4)在肝癌病人中与mRNA表现出一致表达,15条LncRNA被检测出呈现出明显差异表达。通过细胞和组织学验证,结果显示IncRNA-C2、LncRNA-P7和LncRNA-P12呈现出明显差异性表达,有统计学意义,遂选定差异表达最明显的LncRNA-P7,并命名为LINC RP1130-1。核质分离实验结果显示:LINC RP1130-1绝大部分存在于细胞质中,则表明LINC RP1130-1很可能通过与某个特定通路蛋白结合发挥其调控功能。在了解了 LINC RP1130-1的作用部位后,我们对其在HCC复发与转移的作用做了进一步的机制研究。第二部分:LINC RP1130-1通过STAT1-MAPK通道影响肝癌的复发与转移研究目的:探索L INC RP1130-1在肝癌复发转移中的可能作用机制。研究方法:通过转染质粒,过表达基因和沉默基因表达技术、蛋白免疫印迹技术、细胞活力测定、细胞增殖与凋亡能力等方法,分别在基因水平,蛋白水平进行实验,寻找LINC RP1130-1的基因靶点和可能的蛋白位点。研究结果:研究表明LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)可以抑制肝癌肿瘤细胞的增殖,促进肝癌细胞的凋亡过程;研究还发现LINC RP1130-1可调控STAT1基因的转录,并进而影响该基因所关联的蛋白质表达水平;其表达量增加可显著降低STAT1基因的转录水平,降低STAT1蛋白和ERK1/2蛋白的表达量。我们认为LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)可能是通过STAT-MAPK信号通路在肝癌复发转移过程中起到重要作用。第三部分:长链非编码RNA (LNCRNA-P7/LINCRP1130-1)与临床信息的关系研究目的:研究LINC RP1130-1与肝癌病人临床相关信息之间的关联关系,探讨LINC RP1130-1在临床诊治中的意义和作用。研究方法:分别测量肝癌组织和癌旁组织中的LINC RP1130-1表达量,将其按照表达量高低分为两组,采用统计学方法分析两组病人之间其他临床信息之间差异。研究结果:研究发现相比较对应的癌旁组织中的表达量,LINC RP1130-1在肝癌组织中的表达量呈现明显低表达,在肝癌细胞系中的验证也证实LINC RP1130-1在肝癌细胞中的表达量低于正常肝细胞,而且LINC RP1130-1低表达组无瘤生存时间(disease free survival, DFS)较高表达组显著延长,两组之间有统计学差异(P=0. 047)。研究中还发现LINC RP1130-1的表达与临床分期、肝硬化,门静脉癌栓、微血管癌栓、肿瘤数量等因素密切相关。受试者曲线面积(Areaundercurve,AUC)为0.74,这表明LINC RP1130-1的表达在肝癌诊断中具有很好的特异性和敏感性,能够很好的用于肝癌的早期诊断。结论:很多研究表明,长链非编码RNA在人体内广泛存在,参与了肝癌的发生发展过程。我们的研究发现,相比较正常肝细胞,LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)在肝癌细胞系表现为显著的低表达,同样,相比较于癌旁组织,LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)在肝癌组织中也表现为显著的低表达,具有统计学差异。进一步将LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)与临床病人资料进行关联分析,发现LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)的表达与临床分期、肝硬化,门静脉癌栓、微血管癌栓、肿瘤数量等因素密切相关。LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)低表达组无瘤生存时间比高表达组显著延长,两组之间有统计学差异(P=0.047)。受试者曲线面积(AUC)为 0.74,表明 LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)的表达在肝癌诊断中具有很好的特异性和敏感性,能够很好的用于肝癌的早期诊断。总的来说,LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)参与了肝癌的发生发展过程,可以作为一类新型的具有生物学功能的临床标志物进一步研究,具有非常广阔的临床应用前景。
【图文】：

肝细胞肝癌,基因芯片,原始信号,患者

解放军医学院博士学位论文逡逑实验结果逡逑一、目标ＬｎｃＲＮＡ的筛选逡逑我们利用基因芯片和生物信息学分析比较得出：肝癌组织与癌旁组织中共有３９１逡逑条ＬｎｃＲＮＡｓ和６３２条ｍＲＮＡｓ有显著差异表达（差异倍数＞２，ＦＤＲ值＜０．０５）。结逡逑果显示：与患者癌旁组织相比较，肝癌组织中有许多ＬｎｃＲＮＡ与ｍＲＮＡ表达量发生逡逑了差异。预示着癌组织中的表观遗传学调控网络发生了很大的改变，有助于后期相关逡逑研究者更好的探讨ＬｎｃＲＮＡｓ与肿瘤疾病转移及复发间的关联。逡逑

差异表达,聚类图,倍数

图２：差异表达ＬｎｃＲＮＡｓ和ｍＲＮＡ聚类图。通过基因芯片筛选，可以发现肝癌与逡逑癌旁组织中有３９１条ＬｎｃＲＮＡｓ邋（左）和６３２条ｍＲＮＡｓ邋（右）有显著差异表达。（ＦＣ＞２，逡逑ＦＤＲＣＯ．邋０５，绿色区域越明亮代表下调倍数越大，红色区域越明亮代表上调倍数越大）逡逑随后我们对上述ＬｎｃＲＮＡ与ｍＲＮＡ进行了共表达分析，分析显示有７条ＬｎｃＲＮＡ逡逑与相应ｍＲＮＡ呈现显著相关性（Ｒ２＞０．９９９），这７条ＬｎｃＲＮＡ在肿瘤中呈现显著下逡逑调趋势（图３．绿色区域越明亮代表下调倍数越大，红色区域越明亮代表上调倍数越逡逑大）。预示着这７条ＬｎｃＲＮＡ与其相应共表达的ｍＲＮＡ调控可能已经失调。在肿瘤发逡逑生发展过程中起着重要的调控作用，同样也预示着这７条ＬｎｃＲＮＡ可能是通过影响逡逑这些ｍＲＮＡ的表达从而发挥其在肿瘤发生发展中的功能。同时，，这些ｍＲＮＡ也可能逡逑是这７条ＬｎｃＲＮＡ的靶基因。逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】