DNA修复蛋白Ku80在食管鳞癌的表达及对顺铂化疗敏感性的作用

发布时间：2019-11-15 17:36

【摘要】：研究背景与目的2011年,世界范围内新增食管鳞癌(Esophageal squamous cell cancer, ESCC)患者约482,000例,其中超过半数ESCC病例发生在中国。近数十年,ESCC的发病率在全球内呈下降趋势,但是东北亚(尤其是中国)仍是ESCC高发区,并且ESCC发病年龄日趋年轻。半个世纪以来,肿瘤早期诊断技术及肿瘤综合治疗方案不断改进,但ESCC患者5年总体生存率仍徘徊在20%-30%。化疗是ESCC治疗的重要组成部分。以顺铂为基础的联合化疗是ESCC标准方案。ESCC具有遗传变异及肿瘤异质性,顺铂对ESCC患者的化疗疗效存在显著的个体差异性,其临床反应率仅为60%。临床亟待探索ESCC高效治疗策略。其中生物学及基因治疗是ESCC的研究热点。近年来,许多研究表明ESCC是多因素诱发,多步骤参与和多基因改变的全身性恶性疾病。数十年来,在食管鳞癌尚未发现特异、高效的靶向治疗基因。ESCC的基因治疗进展缓慢。其最大的障碍就是基因靶点的选择。内源性和外源性DNA损伤在ESCC发生和进展过程中起关键作用。细胞DNA双链断裂是最危险的DNA损伤形式(double strand break, DSB)。DSB有两种修复方式：DNA同源重组修复(homologous recombination repair, HRR)和DNA非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ),两种修复方式差异巨大,但功能互补。在简单的真核生物(酵母菌)主要依靠HR修复DSB；而复杂高等生物主要依靠NHEJ。Ku蛋白是NHEJ途径早期应答蛋白。Ku蛋白异常可引起机体DSB修复障碍,DNA不稳定,癌症倾向及免疫异常。Ku蛋白是Ku70与Ku80形成的异二聚体。Ku70基因与LO℃389901基因,又称X线修复交叉互补基因6假基因2 (X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6 pseudogene 2)高度同源,靶向沉默或者过表达Ku70可能影响LOC389901基因。Ku80蛋白除了参与DSB NHEJ途径外,还具有更重要的功能：维持染色体端粒稳定、参与免疫球蛋白编码基因V(D)J链重排,调节细胞增值、凋亡、下游基因表达及信号传导。并且,Ku80在多种人类实体肿瘤内异常转录,与结肠、肝、乳腺及肺的恶性肿瘤进展相关。因此,本研究以Ku80为目标基因。我们前期研究表明：Ku80在ESCC高表达并与其恶性进展相关。然而,Ku80表达水平对ESCC顺铂化疗敏感性的影响尚不明确,Ku80基因在ESCC的分子生物学功能仍需进一步探索。本研究分别从基因和蛋白水平检测Ku80在ESCC组织中的表达,探讨临床病理特征及预后的相关性。应用RNA干扰沉默Ku80,探索在ESCC的分子生物学功能；通过细胞培养探究Ku80对ESCC体外顺铂敏感性的作用。建立ESCC病人源性免疫缺陷小鼠移植瘤(preclinical patient-derived esophageal squamous cell carcinoma xenograft, PDECX)模型,利用PDECX模型检测局部注射慢病毒介导的短发卡RNA(small hairpin RNA, shRNA)沉默Ku80对ESCC体内生长的作用；并探索沉默Ku80逆转ESCC顺铂化疗耐药的体内效果。本研究旨在于评价Ku80作为ESCC靶基因的意义,为ESCC治疗开拓新思路。第一部分 Ku80在食管鳞癌组织的表达及临床意义目的1.探讨Ku80在ESCC组织中的表达变化。2.研究ESCC组织Ku80表达水平与临床病理学特点及预后的相关性。方法1.选取从2003年1月到2003年6月山东大学附属山东省立医院住院治疗的119例ESCC患者,建立ESCC临床资料库。同时选取109例行胃镜检查的单纯胃炎患者作为阴性照组,建立阴性对照组临床资料库。另筛选从2000年2月至2004年2月于山东大学附属山东省立医院胸外科行Ivor-Lewis手术的217例胸中段pT2NOMO期ESCC患者,建立pT2NOMO期ESCC临床资料库。食管癌患者收集ESCC组织和癌旁正常食管黏膜(corresponding healthy mucosa, CHEM);阴性对照组收集其正常食管黏膜(normal esophageal mucosa, NEM),建立临床组织标本库。2.应用RT-PCR和免疫组化染色检测119例ESCC患者及109例对照组食管黏膜中Ku80 mRNA及蛋白表达水平；应用免疫组化染色及Western blotting检测217例pT2N0M0患者ESCC组织Ku80蛋白表达差异。3.受试者特征曲线(receiver operating characteristics curve, ROC)分析,确定Ku80差异性表达的临界值(cut-off value), Kaplan-Meier绘制生存曲线,Log-rank生存分析。应用Cox风险模型,多因素分析ESCC患者生存独立危险因素。结果1.119例食管癌患者ESCC组织内Ku80 mRNA (5.348 ± 1.480)表达水平显著高于远端CHEM (3.327±1.106)及109例阴性对照组NEM (3.149±1.092) (ANOVA; P0.001,P0.001)。ROC曲线分析显示：Ku80 mRNA表达临界值为4.35时具有最大敏感性(74.8%)及特异性(87.2%),曲线下面积(area under the ROC curve, AUC)为0.878(95%CI,0.829-0.918)。119例食管癌患者ESCC组织内Ku80免疫组化评分(9.656±4.633)显著高于远端CHEM (5.608±3.759)及109例阴性对照组NEM(5.532±3.741) (Mann-Whitney U test; P0.001,P0.001)。ROC曲线分析显示：Ku80免疫组化评分为9时具有最大敏感性(67.0%)及特异性(87.2%)。2.217例胸中段pT2N0M0期食管癌患者ESCC的Ku80免疫组化评分显著高于CHEM (Mann-Whitney U test; P0.001)。Western blotting结果示ESCC内Ku80蛋白表达(0.907±0.086)比CHEM (0.364±0.052)显著增高(t test; P=0.001)。ROC曲线分析显示：Ku80阈值为9时具有最大敏感性(67.9%)及特异性(85.1%),AUC为0.866(95%CI,0.807-0.912)。3.卡方分析显示119例ESCC患者的Ku80 mRNA的表达与肿瘤分化(P=0.016),局部浸润(P=0.016),淋巴结转移(P=0.002)和TNM分期(P=0.001)相关；Ku80蛋白表达与肿瘤分化(P=0.001),局部浸润(P=0.004),淋巴结转移(P=0.007)和肿瘤分期(P=0.002)相关。217例pT2N0M0期ESCC患者的Ku80与肿瘤大小(P=0.018),分化程度(P=0.010),和TNM分期(P=0.001)密切相关。4.119例ESCC患者Cox多因素生存分析示：局部浸润(P=0.011),淋巴结转移(P=0.009), TNM分期(P0.001), Ku80 mRNA表达水平和蛋白水平(P=0.024,P=0.007)是总体生存(overall survival, OS)的独立预后因素。217例pT2N0M0期ESCCCox比例风险模型显示：肿瘤局部浸润,淋巴结转移,TNM分期,Ku80蛋白表达水平是OS和无病生存(disease-free survival, DFS)的独立预后影响因素。结论1.与正常食管黏膜及癌旁组织相比,Ku80在ESCC异常高表达。2. Ku80 mRNA及蛋白表达水平与ESCC患者的恶性临床病理学特点密切相关。3. Ku80 mRNA及蛋白水平可以评估ESCC的生存,是预后的独立危险因素。第二部分 靶向沉默Ku80对ESCC细胞生物学行为及顺铂体外化疗敏感性的作用目的1.研究Ku80基因在ESCC的生物学功能。2.明确特异性沉默Ku80对ESCC体外顺铂化疗敏感性的影响。方法1.体外培养293T感受态细胞,ESCC细胞系ECA109和KYSE150; LB培养基培养大肠杆菌菌株DH5α；无特定病原体(specific pathogen free, SPF)条件饲养BALB/ cNude鼠。2. Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库检索Ku80(NM_021141)的基因序列,设计并筛选多个siKNA干扰靶点序列及scramble序列。合成DNA oiigo并与线性化载体连接,经大肠杆菌菌株DH5a转化,293T感受态细胞病毒包装及病毒滴度测定后,构建GV115慢病毒介导的shRNAKu80,3.根据细胞感染倍数(multiplicity of infection, MOI)值,将GV115慢病毒介导的shRNA载体及scramble载体转染ESCC细胞系ECA109和KYSE150o经连续培养,筛选成功转染ECA109和KYSE150细胞。4.应用RT-PCR及Western blotting检测转染后ECA109和KYSE150细胞的Ku80mRNA及蛋白表达水平,验证Ku80沉默效率并筛选效果最好的shRNAo5.CCK-8检测ECA109和KYSE150细胞增值活力,并绘制细胞生长曲线。集落形成实验探讨ECA109和KYSE150集落形成能力变化。细胞划痕及transwell实验检测细胞运动,迁移及侵袭能力改变。流式细胞仪探讨ECA109和KYSE150细胞凋亡及细胞周期变化。BALB/c裸鼠种植实验检测ECA109和KYSE150成瘤能力。6.配制顺铂梯度浓度的细胞培养基,培养转染前后ECA109和KYSE150细胞,检测ESCC细胞体外顺铂化疗敏感性变化。7.采用SPSS统计软件包分析数据,数值变量多组比较用ANOVA分析方法,数值变量两个独立组分析采用t检验。P0.05定义为有统计学意义。结果1.筛选3个具有最佳动力学参数的siRNA序列,成功制备GV115慢病毒介导的shRNA载体：shRNA1,shRNA2和shRNA3;根据scramble序列,构建慢病毒介导的scramble为阴性对照。GV115慢病毒介导的shRNA载体感染ECA109和KYSE150细胞后,细胞培养状态良好,感染率90%。2. RT-PCR结果显示：未感染及感染shRNA-scramble, shRNA-1, shRNA-2, shRNA-3的ECA109细胞Ku80 mRNA相对表达量分别为1,0.912±0.061,0.584±0.038,0.429±0.027,0.112±0.015；未感染及感染shRNA-scramble, shRNA-1, shRNA-2, shRNA-3的KYSE150细胞的Ku80 mRNA相对表达量分别为1,0.923±0.071,0.596±0.047,0.445±0.037,0.173±0.025。shRNA-3感染ECA109和KYSE150细胞的Ku80 mRNA表达量最少,相比于shRNA-scramble感染细胞有统计学差异(ANOVA; P0.001, P0.001)。3. Western blotting结果显示：未感染及感染shRNA-scramble, shRNA-1, shRNA-2, shRNA-3的ECA109细胞Ku80蛋白相对表达量分别为0.845±0.088,0.713±0.083,0.427±0.053,0.316±0.041,0.198±0.03；未感染及感染shRNA-scramble, shRNA-1, shRNA-2, shRNA-3的KYSE150细胞的Ku80蛋白相对表达量分别为0.823±0.091,0.745±0.069,0.448±0.053,0.326±0.047,0.182 ■ 0.027o shRNA-3感染ECA109和KYSE150细胞的Ku80蛋白表达量最少,相比于shRNA-scramble感染细胞有统计学差异(ANOVA; P0.001, P0.001)。因此,选择shRNA-3为shRNA Ku80并进行下步功能学实验。4.CCK-8结果显示shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150增值速度比shRNA scramble感染细胞明显下降；而shRNA scramble感染ECA109和KYSE150与未感染细胞的增值速度无明显差异,说明Ku80沉默对ECA109和KYSE150增殖活力有显著抑制作用。5.未感染,shRNA scramble感染,shRNA Ku80感染的ECA109形成的克隆数目分别为481±43,398±45,187±32。未感染,shRNA scramble感染,shRNAKu80感染的KYSE150形成的克隆数目分别为543±52,406±47,224±38。未感染ECA109和KYSE150与shRNA scramble感染组无显著差异,与shRNAKu80感染细胞有明显的统计学差异(ANOVA; P0.001, P0.001)。6.划痕实验证明shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150运动至划痕处细胞数相比于未感染细胞显著下降(ANOVA; P0.001, P0.001), shRNA scramble感染组未有显著变化。Transwell实验证实,shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150细胞的迁移和侵袭能力均较未感染细胞有明显降低,而shRNA scramble感染细胞未有明显改变。7.流式细胞术证实shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150凋亡率显著增加,而shRNA scramble感染细胞无显著增加。shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150细胞相比于未感染细胞G2/M期比例增加,G1/G0期比例降低(X square; P0.001, P0.001)。shRNA scramble感染细胞周期无显著改变。8. BALB/c裸鼠种植实验表明：shRNA Ku80组,shRNA scramble组和空白对照组平均ECA109细胞移植瘤体积分别为3923±418 mm3,3462±357 mm3,923±89 mm3。shRNA Ku80组, shRNA scramble组和空白对照组平均KYSE150细胞移植瘤体积分别为3698±384 mm3,3395±341 mm3,846±74 mm3. shRNA Ku80 ECA109及KYSE150细胞种植瘤显著低于对照组种植瘤(ANOVA; P0.001, P0.001)。9.浓度梯度顺铂体外化疗检测结果显示：顺铂对未感染,shRNA scramble感染,shRNA Ku80感染ECA109细胞的IC50为85.97μg/ml,79.49μg/ml,8.22μg/ml。顺铂对未感染,shRNA scramble感染,shRNA Ku80感染KYSE150细胞的IC50为75.45μg/ml,72.40μg/ml,9.59μg/ml。与未感染细胞相比,shRNA Ku80感染ECA109和KYSE150对顺铂体外化疗敏感性显著增强。结论1.靶向Ku80沉默显著抑制ESCC增值,克隆形成,运动,迁移,侵袭及种植瘤体内生长。2.Ku80基因沉默促进ESCC细胞凋亡,阻滞细胞周期。3.靶向沉默Ku80基因提高ESCC细胞对顺铂体外化疗的敏感性。第三部分 建立PDECX模型,评估靶向沉默Ku80对ESCC顺铂体内化疗敏感性的作用目的1.建立PDECX模型,评估局部注射慢病毒介导的shRNA沉默Ku80的体内效果。2.以PDECX模型为实验平台,探索沉默Ku80对ESCC顺铂体内化疗敏感性的作用。方法1.于2014年3月至2014年7月连续收集山东大学附属省立医院胸外科行食管鳞癌切除术的患者,收集新鲜ESCC组织。经RT-PCR检测,选取Ku80 mRNA高表达ESCC组织碎块分别种植至BALB/c裸鼠皮下。并经过三代鼠-鼠连续传代种植,建立PDECX模型。2. PDECX模型随机分为3组。shRNA Ku80实验组：瘤体多部位局部注射GV115慢病毒介导的shRNA Ku80; scramble对照组：瘤体多部位局部注射GV115慢病毒介导的shRNA scramble;空白对照组：瘤体多部位局部注射polybrene(E)。3. PDECX模型成瘤5周后,给予BALB/c裸鼠顺铂注射液,测量肿瘤生长体积. PDECX模型生长8周后取出,测量肿瘤湿量及体积,检测顺铂体内化疗敏感性。4. RT-PCR,免疫组化染色及Western blotting实验评估PDECX模型Ku80体内特异性沉默效果。结果1.选取Ku80 mRNA高表达98例新鲜ESCC组织种植于BALB/c裸鼠成瘤93例,第一代鼠-鼠传代成瘤53例,第二代成瘤48例,第三代成瘤45例。经连续三代鼠-鼠连续传代种植后,成功建立PDECX模型45例随机分3组,shRNA Ku80实验组,scramble对照组,空白对照组各15例。2. RT-PCR显示shRNA Ku80实验组,scramble对照组,空白对照组PDECX瘤体组织Ku80 mRNA相对表达量为0.254±0.028,0.876±0.057,0.903±0.061。免疫组化染色显示空白对照组及scramble对照组瘤体组织Ku80高表达,呈细胞核颗粒性黄染。shRNA Ku80实验组瘤体组织Ku80细胞核着色显著减少。shRNA Ku80组,scramble组,BC组种植瘤组织Ku80蛋白相对表达量为0.268±0.019,0.793±0.054,0.912±0.071。相比于空白对照组,shRNA Ku80实验组瘤体Ku80蛋白表达量显著降低(ANOVA; P0.001)。3. PDECX肿瘤生长5周时,shRNA Ku80组,scramble组,BC组种植瘤体积分别为3291±156 mm3,6653±317 mm3,7247±428 mm3。继续饲养3周后,shRNA Ku80组,scramble组,BC组种植瘤体积为483±72mm3,3974±189mm3,4526±247mm3。shRNA Ku80实验组,scramble对照组,BC组PDECX肿瘤湿重分别为0.636±0.062g,3.851±0.389g,4.124±0.573g。shRNA Ku80实验组瘤体重量显著小于空白对照组(ANOVA; P0.001)。结论1.局部注射慢病毒介导shRNA能特异性沉默PDECX种植瘤组织内Ku80表达。2.Ku80沉默显著抑制体内PDECX种植瘤的生长。3.特异性沉默Ku80提高PDECX肿瘤对顺铂体内化疗敏感性。
【图文】：

－ｐｅｃｃｉｙ逡逑图ｌ．Ｋｕ８０在１１９例ＥＳＣＣ组织中高表达。逡逑；邋ＲＴ－ＰＣ民分析ＫｕＳＯｍＲＮＡ表达水平；Ｂ：邋ＲＯＣ分析确定ＫｕＳＯｍＲＮＡ高表值；Ｃ；免疫组化染色检测Ｋｕ８０蛋白水平；Ｄ：邋ＲＯＣ分析确定Ｋｕ８０蛋白高界值。ＥＳＣＣ：食管淲癌；ＣＨＥＭ：癌旁正常黏膜；ＮＥＭ：正常食管黏膜；ＲＯＣ：者特征曲线；ＩＨＣ：免疫组织化学染色。逡逑

邋逦邋Ｂ邋１．０－邋－ｎ逦－ｎ邋ｈｉｇｈ邋Ｋｕ８０邋ｉｎＲＮＡ逦１．护逦－Ｔｉ邋ｈｉｇ！ｉ邋Ｋｕ８０邋ｐｒｏｔｅｉｎNB逦－ｎｉｏｗＫｕＳＯｒａＲＮＡ逦＼＼逦－ｎ｜0ｗＫｉｉ８０邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑邋ｒ邋ｔｖ逡逑ｒ逡逑邋０４－逦１－－逦Ｖ邋ｋ逡逑邋０．２－逦＼＼邋Ｉｃ－逡逑０．０－逦Ｓ逦０．０－逦＊—Ｓ＿？逦、逡逑０逦２５逦５０逦７５逦１００逦１２３逦０逦２５逦５０逦７５逦１００逦１２５逡逑Ｔｉｍｅ邋如ｏｎｔｈｓ）逦Ｔｉｍｅ邋（ｍｏｎｔｈｓ）逡逑３．邋Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ邋分析邋１１９邋例邋ＥＳＣＣ邋患者总体生存（ｏｖｅｒａｌｌ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ，邋ＯＮＡ（Ａ）和蛋白巧）高表达患者预后较差。ＥＳＣＣ：食管淲癌（ｅｓｏｐｈａｇｓ邋ｃｅｌｌ邋ｃａｒｃｉｎｏｍａ）。逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
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本文编号：2561411